從水華魚腥藻(Anabaena flos-aquae)分離的神經毒素。該毒素活性高，毒性大。但神經毒素不穩定，半衰期短，尤其在光照和高pH條件下，可迅速降解為無毒。
基本介紹
- 中文名：魚腥藻毒素a
- 外文名：anatoxin-a
- 所屬學科：海洋科技
- 毒素分類：神經毒素
- 毒性：LD50=200μg/kg
簡介,物化特性,化學性質及結構,合成,毒理,毒性,毒代動力學,毒素檢測,毒素去除方法,
簡介
隨著工農業生產的發展，大量氮、磷排入水體中，導致水體富營養化日益嚴重，內陸水體富營養化的加劇必將引起有害藻類菌絨（Harmful algal bloom，HAB）頻繁發生，其中藍細菌水菌絨（Water bloom）是淡水水體中危害最嚴重的一類，中國一些學者將Water bloom譯為“水華”或“水花”。淡水水體富營養化危害最大的一個表征是藍細菌菌絨的出現，菌絨形成後，水面被一層藍色油膜所覆蓋，在岸邊也大量堆積，就象一層厚厚的綠色油漆，它的瘋長泛濫速度甚至可跟海洋赤潮相提並論；菌絨瘋長時，不僅大量消耗水中的溶解氧，散發腥臭，嚴重影響環境，而且釋放毒素，導致大量生物死亡，破壞生物多樣性。
魚腥藻毒素a由藍細菌（Cyanobacterium）的水華魚腥藻（Anabaena flos-aquae）屬產生，其他種的魚腥藻也能產生毒素，不同的種產生毒素的量和種類也不一樣，而且隨著季節變化較大。Stanier用電子顯微鏡研究了上述藻類細胞結構，發現構成藍綠藻的細胞並不是真核細胞，他認為，命名為藍細菌要比藍綠藻更科學、準確，20世紀90年代以後國外文獻亦逐漸使用Cyanobacterium替代Blue-green algae。他取魚腥藻的英文詞頭ana-和toxin命名魚腥藻毒素，與生物學名詞蛋白質類化合物anatoxin（類毒素，變性毒素，去毒毒素，英文詞頭ana-有類似、變化、沒有的意思）相同純屬巧合，因此，在文獻中以anatoxins（魚腥藻毒素總稱）或anatoxin-X（某種魚腥藻毒素）的形式區別於anatoxin，而anatoxin的生物學意義是相對於某種蛋白毒素，具有與毒素類似的結構（免疫識別的胺基酸殘基序列），沒有毒性，能產生免疫作用對抗該種毒素，毒素變性滅活或化學修飾後可成為anatoxin，具有與毒素類似結構的同源蛋白是天然的anatoxin，中國一些學者將魚腥藻毒素誤譯為類毒素或變性毒素。
魚腥藻毒素a屬魚腥藻毒素，由藍細菌（Cyanobacterium）的水華魚腥藻（Anabaena flos-aquae）屬包括水華魚腥藻（Anabaenaflos-aquae）、顫藻（Oscillatoria）、束絲藻（Aphainizomenon）、節球藻（Nodularia）等產生。其它種的魚腥藻也能產生毒素，但不同種所產毒素的量和種類不同，而且隨季節變化較大。通常魚腥藻毒素被劃分為anatoxin-a（antx-a，魚腥藻毒素a）、homoanatoxin-a（homoantx-a，魚腥藻毒素同系物a）、anatoxin-a（s）（antx-a（s），魚腥藻毒素a（s））以及antx3/b、antx-b（s）等種類，其中前3種的化學結構已經確定。
魚腥藻毒素結構式
魚腥藻毒素結構式物化特性
化學性質及結構
魚腥藻毒素a的晶體結構和絕對構型經Huber和Koskinen等測定為S-trans-（1R，6R）-（+）2-乙醯基-9-氮雜雙環[4，2，1]-壬-2-烯，相對分子質量165，AnTX-a（s）的結構在1989年由Matsunaga等確定，相對分子質量252，CD譜測定AnTX-a（s）的光學活性為（-）的光活體，1H和13C NMR解析的分子結構中存在S構型的手性碳，極性強，溶於水等極性溶劑，在鹼性條件下不穩定。HomoAnTX-a是AnTX-a的乙醯基被丙醯基取代的結構類似物，藥理作用與AnTX-a相似。
魚腥藻毒素紫外光譜
魚腥藻毒素紫外光譜1977年，Devlin首先從水花魚腥藻NRC-44-1中分離出了魚腥藻毒素a，證明它是一種神經毒鹼，相對分子質量量為166D，小鼠的90%致死劑量為0.3mg/kg。Huber和Koskinen等測定了antx-a的晶體結構和絕對構型，為：S-trans（1R，6R）-（+）2-乙醯基-9-氮雜雙環[4，2，1]-壬-2-烯，相對分子質量165。由於它的分子結構具有半剛性，酷似乙醯膽鹼，不被酶解，因而活性高，毒性大。但神經毒素不穩定，半衰期短，尤其在光照和高pH條件下，可迅速降解為無毒。
Homoantx-a在結構上和antx-a很相似，只是其中的乙醯基換成了丙醯基，由Wonnacott等在1992年首次合成，其毒力也與antx-a相近。1992年，Skulberg等從中國台灣Osillatoria中分離homoantx-a，採用腹膜注入的方式時，對小鼠的致死劑量為288~578μg/mL。2003年，Watanabe等鑑定了有毒菌株Raphidiopsis mediterranea LBRI 48的毒素成分。接著，Namikoshi等改良了以前的分離步驟，對同株菌分泌的antx-a、homoantx-a和一種新的homoantx-a衍生物4-羥基homoantx-a毒素進行了分離鑑定，這是對同一株藍藻細菌同時產生antx-a和homoantxn-a的第1次報導。
魚腥藻毒素分離純化光譜
魚腥藻毒素分離純化光譜魚腥藻毒素a（s）最早是從水華魚腥藻NRC52517中分離到的有機磷酸酯。研究表明，同魚腥藻毒素a一樣，魚腥藻毒素a（s）也為生物鹼類物質，具有與魚腥藻毒素a類似的擬膽鹼作用，可影響乙醯膽鹼的正常釋放，導致神經肌肉過度興奮而痙攣，最後致使動物呼吸受限窒息死亡。但是，魚腥藻毒素a（s）並不像魚腥藻毒素a那樣具有直接的激動劑和神經肌肉阻斷劑活性，它是一種潛在的乙醯膽鹼酯酶抑制劑，和神經致毒劑甲氟膦酸異丙酯具有相同的功效。魚腥藻毒素a（s）的結構在1989年由Matsunaga等確定，相對分子質量252，CD譜測定魚腥藻毒素a（s）的光學活性為（-）的光活體，二維核磁共振測定其分子結構中存在S構型的手性碳，極性強，溶於水等極性溶劑，在鹼性條件下不穩定。魚腥藻毒素a（s）對小鼠有高於魚腥藻毒素a10倍的毒性，Mahmood等研究了酶抑制反應動力學，進一步確定了魚腥藻毒素a（s）是非競爭性膽鹼酯酶抑制劑，且對酶有不可逆抑制作用。
合成
魚腥藻毒素a在結構被解析後，許多學者對其進行了全合成研究：Cambell等（1977）用天然（2R，3S）-鹽酸古柯鹼合成了（+）-AnTX-a；Bates等（1979）用甲基吡咯合成了AnTX-a；Petersen等（1984）用DL谷氨酸合成了光學純度的（+）和（-）的AnTX-a；Tufariello等（1984）用吡咯-1-氧化物合成了（±）AnTX-a；Danheiser等（1985）分別用環庚-4-酮和四溴三環辛烷合成了（±）AnTX-a；Wiseman等（1986）用（1，5）-環辛二醇合成了（±）AnTX-a；唐洪春等（1990）改進了Cambell的合成方法，經8步反應合成了（+）AnTX-a。
由於AnTX-a活性高（IC50，10-9mol·L-1），是N-受體激動劑最典型的代表物，許多學者運用分子力學、量子力學、二維核磁和X-光晶體衍射的方法研究了AnTX-a與N受體相互作用的結構特點，發現：（1）AnTX-a的乙醯基不被酶水解；（2）N9與受體作用時能形成強的靜電作用；（3）羰基O與受體能形成氫鍵；（4）C=C-COCH3的α，β不飽和酮平面結構保證了與受體的很好結合，並且能形成疏水作用。但不同方法對AnTX-a的藥效構象研究卻有不同結果：晶體結構研究表明，反式是穩定構象；二維核磁研究表明，兩種構象同時存在；MMP2程式計算表明，順式比反式構象穩定；MMX、MOPAC、COSMIC和GAUSSIAN程式計算表明，反式比順式構象穩定；Hacksell等套用“活性類似物方法”和Nicolotti等運用經典的Hansch方法和比較分子場分析法（CoMFA）分析，認為AnTX-a的藥效構象為反式構象。對於AnTX-a（s），含活潑P-O-N鍵的磷酸酯基、胍基和三級胺基是重要的活性基團，胍基和三級胺基2個基團與膽鹼酯酶形成雙陰離子位點作用，保證了它的高活性。
魚腥藻毒素合成示意圖
魚腥藻毒素合成示意圖毒理
毒性
魚腥藻毒素a及其異構體AnTX-a（s）是最重要的兩種魚腥藻毒素，他們毒性大，活性高，對環境影響大，因而受到關注。魚腥藻毒素-a（AnTX-a）在藍細菌的水華魚腥藻（Anabena flos-aquae NRC-44-1）的細胞里是含量最高的一種毒素，因而，最先分離提取到，這個生物鹼作用於突觸後膜，是強效擬膽鹼去極化神經肌肉阻斷劑。進一步的藥理研究表明，AnTX-a是菸鹼樣膽鹼受體激動劑，在與菸鹼樣受體相互作用時，（+）的異構體比（-）的異構體強1000倍，它的分子結構具有半剛性，酷似乙醯膽鹼（乙醯基與雙鍵形成的平面結構，相當於乙醯膽鹼的酯橋平面），不被酶解，因而活性高，毒性大，有“極速致死因子”（very fast death factor）之稱，LD50=200μg·kg-1（ip. mouse），由於其分子的剛性和高活性，它是研究配基與菸鹼樣膽鹼受體相互作用的很好探針。antx-a是一種毒性劇烈的生物鹼神經毒素（例如：對老鼠的半致死量為200μg/mL），具有很強的菸鹼樣神經肌肉去極化阻斷作用，動物中毒後會出現肌束抽搐、角弓反張、呼吸肌痙攣、流涎等症狀。
關於antx-a對動物的毒性研究已報導甚多，但對植物的毒性作用知之甚少，Mitrovic等首次報導了antx-a對水生植物的毒力影響。
魚腥藻毒素-a（s）（AnTX-a（s））最早是從水華魚腥藻（anabaena flos-aquaeNRC-525-17）中分離到的有機磷酸酯，研究表明，AnTX-a（s）具有與AnTX-a類似的擬膽鹼作用，但並不像AnTX-a具有直接的激動劑和神經肌肉阻斷劑活性，它的藥理作用分子機制完全不同於AnTX-a。用實驗室培養產毒藻株（Anabaena flos-aquaeNRC-525-17）的方法產生毒素，然後分離純化，得到毒素，由於毒素不純，測得LD50（ip. mouse）在40~60μg·kg-1的範圍內，大約50μg·kg-1，而且小鼠死亡時間在30~6min，急性毒性症狀有：流涎、流淚、尿失禁、縮瞳、痙攣、呼吸抑制等。分別用阿托品和d-筒箭毒鹼對抗An-TX-a（s）的藥理作用，實驗表明，前者能延長小鼠的存活時間，後者能使肌肉痙攣完全消失，說明AnTX-a（s）可能是膽鹼酯酶抑制劑，既能引起菸鹼樣作用，也能引起毒蕈鹼樣作用。Mahmood等研究了酶抑制反應動力學，進一步確定了AnTX-a（s）是非競爭性膽鹼酯酶抑制劑，而且對酶進行不可逆抑制。
毒代動力學
酶的親合作用比DFP強110倍，雙分子抑制常數比DFP強22倍。在進行毒性評價時，毒素含量只有70%~80%（TLC），測得LD50（ip. mouse）為大約40μg·kg-1，死亡時間小於30min。研究表明LD50（ip. mouse）30~50μg·kg-1的數據，毒素含量大約80%（TLC），0.44μg·mL-1的毒素在3min內能抑制酶的全部活性，用水稀釋不能使酶恢復活性，即使稀釋100倍，1h內仍不能使酶恢復絲毫活性。Hyde等的研究表明，用高濃度的解磷定（2-PAM）、雙解磷（TMB4）能使被毒素抑制的酶有效恢復，而可逆抑制劑毒扁豆鹼、阿托品能有效地保護酶和對抗毒素的抑制，同時測得酶活性Ic953.1×10-8mol·L-1，LD50（ip. mouse）大約20μg·kg-1。
Cook等按照Mahamood的方法培養藻株，分離並純化毒素，對小鼠腹腔注射，用吡啶斯的明（pyridostigmine），毒扁豆鹼（physostigmine），對氧磷（paraoxon）對比實驗，發現AnTX-a（s）並不抑制大腦等中樞神經系統的膽鹼酯酶，被認為是由於AnTX-a（s）不能穿過血腦屏障，同時測得LD50（ip.mouse）約為31μg·kg-1，毒素含量80%~90%（TLC）。50mg·kg-1的阿托品能延長存活時間和增加致死劑量25%~35%，致死劑量的毒素能引起血壓、心率、呼吸頻率、肺活量突然下降，同時測得LD50（ip.mouse）約為21μg·kg-1，毒素含量90%~95%（TLC）。值得注意的是進一步的研究工作，用鼠進行毒性測定，分3組，每組8隻鼠做LD50值測定實驗，（a）1.5μg·kg-1劑量時，中毒症狀不明顯，只見到活動減少；（b）3.0μg·kg-1劑量時，產生明顯中毒症狀：流涎、流淚、縮瞳、尿失禁、運動減少、痙攣；（c）9.0μg·kg-1劑量時，在1h內全部死亡，按照“Bruce法”計算出LD50（ip.mouse）為5.3μg·kg-1，800μg·kg-1劑量的對氧磷（paraoxon）與3.0μg·kg-1劑量的AnTX-a（s）產生相同的中毒症狀，同時測定鼠神經系統不同部位的酶活性，發現大腦和頸部以上脊髓無抑制，同樣在下丘腦、延髓也未觀察到酶的抑制現象，說明AnTX-a（s）是一個強的專一性外周神經膽鹼酯酶抑制劑。由於獲取的天然毒素不純，急性毒性評價得到了不同的數據，但有學者認為，動物致死的主要原因是呼吸抑制，毒素專一性地作用於外周神經系統，而不抑制中樞神經系統，因而死亡過程緩慢，這種藥理作用顯然不同於G類（氟磷酸酯或氰基磷酸酯）和V類（全酯中有一個被硫取代的磷酸酯）戰劑，而且也與作用於中樞的可逆性膽鹼酯酶抑制劑不同，這些可逆性抑制劑常用於治療老年性痴呆。
毒素檢測
魚腥藻毒素a的檢測方法主要分為生物測試法（主要為小鼠測試法）、化學分析法、免疫檢測法3種。生物測試只可較為粗略地判斷藻提取物是否有毒性，結果較為直觀、快速，但無法定量；化學分析可做出精確定性定量測定，運用恰當可測到各組分的ng級含量；免疫檢測比化學法具有更高的靈敏度，但由於魚腥藻毒素a單克隆抗體的製備較難和普及使用率不廣，故選擇性略差。有些方法專一性相對較差，只能用於定性測試或魚腥藻毒素總量測定，無法精確定量或鑑定毒素成分和區分毒素同系物。例如小鼠生物檢測法（mouse bioassay，MBA）只能測出其毒性大小，無法確知其組成及含量，並且測試過程複雜，不確定的因素多，重複性和靈敏性差，所需時間也較長；神經結合受體結合檢測法由於針對的是毒素的功能而非結構，因而不能對毒素進行分類。
魚腥藻毒素電泳圖免疫檢測法的原理主要是利用放射性或螢光物質標記魚腥藻毒素a抗體，以之特異性結合魚腥藻毒素a類抗原物，通過檢測放射性或螢光強度以測定樣品中毒素含量。主要有酶聯免疫測定法（ELISA）、放射免疫分析（RIA）和競爭性酶免疫分析（EIA）等類型。在具備魚腥藻毒素單克隆抗體、標準純毒素和有關試劑的前提下，尤其是使用商品化的試劑盒時，使用ELISA法是非常簡便、高效、快速的方法。該方法的靈敏性要比相應的小鼠生物法或HPLC法高的多，檢測毒素的含量在pg級，且專一性強。
毒素去除方法
常用的魚腥藻毒素a的去除方法主要包括物理、化學、光降解法和生物降解法等。
物理降解法是常規的去除魚腥藻毒素a的方法，包括凝絮、混凝沉澱、快速過濾及慢速砂濾、氣體浮選及活性炭粉末（PAC）吸附、膜處理等。凝絮可以有效去除藻類細胞，但在去除水溶性藻類毒素方面卻不是很有效；其去除藻類的效率主要取決於適宜的凝絮劑化學劑量及pH值，凝絮過程可能使藻類細胞裂解而釋放出毒素。混凝沉澱通過加入混凝劑（例如硫酸鐵）去除藻類而去除細胞內魚腥藻毒素a，但對細胞外的溶解性魚腥藻毒素a無去除作用。快速過濾通常是在凝絮過後採用的一種方法，主要用以去除凝絮產生的絮狀物，而不能有效地去除藻類細胞。慢速砂濾可去除部分細胞外魚腥藻毒素，對細胞內魚腥藻毒素a的去除作用較弱。套用溶解氣體浮選去除魚腥藻毒素a的時候，應注意到不同藻類不同的物理特性。研究表明，氯化、砂濾、凝絮等並不能有效去除藻類毒素，只有活性炭粉末處理才能有效去除。而在套用活性炭粉末時，劑量是一個很重要的參數，同時，碳源種類也十分重要（煤，木頭，椰子，泥等）。在用活性炭粉末處理水的時候會在接觸表面產生生物膜，這層生物膜會顯著削弱濾層去除毒素的能力，而且這層生物膜也很難降解。
化學降解法主要有氯化處理和臭氧化處理。通常來講，氯化處理在破壞毒素方面並不是一個十分有效的方法，其處理效率在很大程度上取決於氯化物的種類及採用的濃度。值得注意的是，氯化處理過程中也容易產生一些有毒的含氯副產物，如三氯甲烷。臭氧化處理對魚腥藻毒素a有很強的去除能力，其氧化機制與ClO2完全不同。ClO2和O3均能有效殺滅藻類、破壞藻體，使魚腥藻毒素a釋放出來。但ClO2對魚腥藻毒素a的去除能力有限，對水中魚腥藻毒素a的最大去除率僅為27%；而臭氧對魚腥藻毒素a的去除非常有效，對水中魚腥藻毒素的去除率可達96%。除上述2種方法外，2004年苑寶玲等研究了高鐵-光催化氧化體系去除水華魚腥藻毒素a的效能，通過投加10mg/L的高鐵到光催化體系中，由於高鐵的強氧化性及其還原產物可作為電子捕獲劑，可將光催化效率從63%提高到100%，可快速完全去除魚腥藻毒素。
魚腥藻毒素a由於結構影響，在紫外燈和日光照射條件下不穩定，很容易被降解，並且魚腥藻毒素a的降解程度與色素含量也有關。對滇池水華藍藻中魚腥藻毒素a光降解的研究發現，滇池水華藍藻提取液中的魚腥藻毒素a不僅可以在日光照射下降解，也可在紫外燈照射下降解，且在日光照射下降解速率更快。提取液中的色素對魚腥藻毒素的光降解起重要作用，並且其含量將決定魚腥藻毒素a的降解程度。為最佳化光降解法去除飲用水中的魚腥藻毒素，分別使用了不同波段的UVA的UVC 2種紫外光源，不同波段的紫外光具有不同的催化效率和降解中間產物；毒素降解的反應速率常數UVC比UVA高了近2個數量級，表明光降解技術去除飲水中的魚腥藻毒素a宜選用UVC光源。光降解可以克服常規物理降解去除魚腥藻毒素a的效率不高以及氯化處理有毒副產物的弊端，是一種較安全也比較有效的去毒方法。
