高效液相色譜柱

高效液相色譜柱的系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內，由於樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配係數, 在兩相中作相對運動時， 經過反覆多次的吸附- 解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出， 通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式列印出來。

原理結構

液相色譜柱的結構：

a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。

柱接頭採用低死體積結構，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸內螺紋，另一端是3/16英寸的內螺紋（國內外已規範化）。7/16英寸內螺紋與1/4英寸柱管（Φ6.35mm）連線，中間放置壓環用於密封。3/16英寸的內螺紋與1/16英寸（Φ1.57mm）的連線管連線，中間也放置壓環用於柱接頭的密封。為了儘量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用Φ1.57mm連線管通過空心螺釘壓環後要儘量插到底，然後再擰緊空心螺釘。壓環被空心螺釘擠壓變形後緊箍在連線管上（連線管通過壓環後露出的管長度應嚴格控制在2．5mm長或其他固定尺寸）。

在兩端柱接頭內，柱管兩端各放置一片不鏽鋼濾片（或濾網），用於封堵柱填料不被流動相衝出柱外而流失。空柱各組件均為316L不鏽鋼材質，能耐受一般的溶劑作用。但由於含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連線管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。

b、柱填料：

液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據填料類型而定。

正相柱：多以矽膠為柱填料。根據外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 μm的範圍內。另一類正相填料是矽膠表面鍵合—CN，-NH₂等官能團即所謂的鍵合相矽膠。

反相柱：主要是以矽膠為基質，在其表面鍵合十八烷基官能團（ODS）的非極性填料。也有無定型和球型之分。

常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10 μm之間。

相關要求

填充劑的要求

最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合矽膠。反相色譜系統使用非極性填充劑，以十八烷基矽烷鍵合矽膠最為常用，辛基矽烷鍵合矽膠和其他類型的矽烷鍵合矽膠（如氰基鍵合矽烷和氨基鍵合矽烷等）也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有矽膠等。離子交換色譜系統使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。

填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。孔徑在15nm（1nm=10Å）以下的填料適合於分析分子量小於2000 的化合物，分子量大於2000 的化合物則應選擇孔徑在30nm 以上的填料。除另有規定外，分析柱的填充劑粒徑一般在3μm~10μm 之間。粒徑更小（約2μm）的填充劑常用於填裝微徑柱（內徑約2mm），使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當的調整。當對其測定結果產生爭議時，應以品種正文規定的色譜條件的測定結果為準。

溫度的要求

以矽膠為載體的普通鍵合固定相的使用溫度通常不超過35℃，為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不能超過60℃。

流動相的要求

流動相的pH 值應控制在2～8 之間。當pH 值大於8 時，可使載體矽膠溶解；當pH 值小於2 時，與矽膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用pH 值大於8 的流動相時，應選用耐鹼的填充劑，如採用高純矽膠為載體並具有高表面覆蓋度的鍵合矽膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非矽膠填充劑等；當需使用pH 值小於2 的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基矽烷鍵合矽膠填充劑，或有機-無機雜化填充劑等。

注意事項

柱效和保護柱

拿到一根新柱時，一定要先看其使說明，然後測柱效，定期檢測柱效， 保留在新色譜柱上得到的色譜圖，並記錄條件， 定期檢測儀器的譜帶展寬。 若套用於線上監測， 應對色譜柱提供線上的物理保護和化學保護， 例如採取安裝線上過濾器， 自裝填料保護柱和預裝保護柱等。線上過濾器的作用是防止顆粒在柱頭累計，優點是基本不影響柱效， 在需要高柱效的時候常用， 常更換的消耗品是濾芯和墊圈保護柱的作用是防止柱子被化學污染。缺點是多數保護柱影響色譜柱的柱效， 特別是在用微柱時，常用的是普通 自裝填料的保護柱。最近新出的一些保護柱例如Sentry—guard保護柱， 它的特點是高質量、高效填料、 增加分析柱效、對髒樣品載荷能力大 ，能延長保護柱的壽命，手可擰緊接頭，安裝時不需要工具，省時省，可換芯式設計，能採用各種不同的填料，主要適用於非常髒非常複雜的樣品本底，例如生化樣品，環境樣品和食品等，或者不想做太多的圃相萃取，不想降低柱效果等情況。

清洗

對所做的樣品要有充分的了解，用對該樣品洗脫能力最強的流動相清洗，對於矽膠柱，先用甲醇洗去極性雜質，然後用乾燥的二氯甲烷和正庚烷 100 — 20OraL依次活化，對於鍵和相柱，一般用甲醇一氯仿一甲醇一水依次沖洗，每種色譜柱有特定的清洗方法，一定要看其使用說明。

存放

存放前除去雜質和鹽，採用合適的存放溶劑，避免色譜柱床的乾枯，避免機械振動，防止細菌生長，注意存放的溫度。

故障排除

1、柱壓過高

可能是微粒堵塞． 柱床膨脹，不可逆吸附， 細菌生長等造成的。也有可能是系統反壓問題， 例如阻尼器堵塞，進樣器堵塞， 管路或連線口堵塞。 線上過濾器不乾淨， 壓力感測器不準確等。

2、柱效低

可能是色譜柱被污染、 過濾片部分堵塞、色譜柱內的死體積造成，例如流動相pH值或者組成不合適造成固定相損失。 流動相急劇變化造成固定相物理損壞， 機械振動造成固定相產生裂縫，柱床收縮或乾枯。也有可能是儀器連線的問題， 認真檢查進樣器、檢測器、 管路、 保護柱和線上過濾器等是否連線好，也可能是色譜柱沒有平衡好， 進樣量過大等問題。

3、重複性差、不出峰、回收率低

可能是色譜柱被污染， 流動相 pH值或者組成不合適造成固定相損失 ， 樣 品溶劑 不同或樣品本身不穩定， 固定 相極性過強或者流動相極性過弱． 或者發生非特異性吸附。也可能梯度實驗時平衡時間不足，溫度波動， 流動相組成改變， 樣品溶劑不同， 樣品穩定性不好，方法的開發不好， 緩衝液的酸鹼度不合適或者緩衝能力不足。