顯微技術

顯微技術（microscopy）是利用光學系統或電子光學系統設備，觀察肉眼所不能分辨的微小物體形態結構及其特性的技術。

基本介紹

• 中文名：顯微技術
• 外文名：microscopy
• 性質：一種技術
• 用途：觀察肉眼所不能分辨的微小物

技術分類

包括：①各種顯微鏡的基本原理、操作和套用的技術；②顯微鏡樣品的製備技術；③觀察結果的記錄、分析和處理的技術。

發展歷史

原始的光學顯微鏡是一個高倍率的放大鏡。據記載，在1610年前義大利物理學家伽利略已製作過複式顯微鏡觀察昆蟲的複眼。這是一種已具目鏡、物鏡和鏡筒等裝置，並固定在支架上的顯微鏡。荷蘭人 A·van·列文虎克一生製作了不少於247架顯微鏡，觀察了許多細菌、原生動物和動、植物組織，是第一個用顯微鏡作科學觀察的人。到18世紀顯微鏡已有許多改進，套用比較普遍，已作為一種商品進行生產。

普通學生光學顯微鏡示意圖

1872～1873年，德國物理學家和數學家E·阿貝提出了光學顯微鏡的完善理論，從此，鏡頭的製作可按預先的科學計算進行。同時，德國化學家O·肖特成功地研製出供製作透鏡的優質光學玻璃。他們和德國顯微鏡製作家卡爾·蔡司合作，建立了蔡司光學儀器廠，於1886年生產出具復消色差油鏡的現代光學顯微鏡，達到了光學顯微鏡的分辨限度。從19世紀後期至20世紀60年代發展了許多類型的光學顯微鏡，如：偏光顯微鏡、暗視場顯微鏡、相差顯微鏡、干涉差顯微鏡、螢光顯微鏡。此外，還有許多特殊裝置的顯微鏡，例如在細胞培養中特別有用的倒置顯微鏡。20世紀80年代後期又發展了一種同焦掃描雷射顯微鏡，結合圖象處理，可以直接觀察活細胞的立體圖，是光學顯微鏡的一大進展。

產生

根據光的波粒二象性可以知道隨著人類認知的發展光學顯微鏡觀察微小物體的範圍已經遠遠不能滿足人們的需求，人們繼續一個解析度更高的顯微鏡，伴隨這對電子、物質波的不斷了解誕生了第一架電子顯微鏡。

1934年由M·諾爾和E·魯斯卡在柏林製造成功第一台實用的透射電子顯微鏡。其成象原理和光學顯微鏡相似，不同的是它用電子束作為照射源，用電子透鏡代替玻璃透鏡，整個系統在高真空中工作。由於電子波長很短，所以解析度大大提高。在電鏡製作的實驗階段就曾嘗試觀察生物材料。1934年布魯塞爾大學的L·馬頓在美國就發表過用鋨酸固定的茅膏菜植物葉子切面的電鏡圖。1949年A·克勞德、K·R·波特和E·皮克爾斯獲得了第一張細胞超顯微結構的電鏡圖。到20世紀50年代，透射電子顯微鏡在生物學的研究中已被廣泛的套用。解析度已由最初的500埃提高到小於2埃。

透射電子顯微鏡

發展

20世紀50年代掃描電子顯微鏡在英國首先製造成功。它是利用物體反射的電子束成象的，相當於光學顯微鏡的反射象。掃描電子顯微鏡景深大，放大倍率連續可變，特別適用於研究微小物體的立體形態和表面的微觀結構。20世紀70年代以來，掃描電鏡發展很快，在固體樣品上可反射多種電子，結合信號分析裝置，已成為研究物質表面結構的有力工具。掃描電鏡的解析度已由最初的500埃提高至50～30埃。電子顯微鏡的另一個發展是研製超高壓電鏡以增加解析度和對原樣品的穿透力。製成了3兆伏的加速電壓的超高壓電鏡，可用來研究整體細胞和物質的分子結構象或原子結構象。

樣品製備技術

1665年英國顯微鏡學家R·胡克把軟木切成薄片才在顯微鏡下觀察到細胞。列文虎克在1714年用藏紅花作肌纖維切片的染色，這一簡單的切片和染色可以說是製片技術的萌芽。從18世紀20年代開始，德國一些研究工作者在染料的發展上作出了很大的貢獻；而英國一些顯微鏡學家則熱心於製片技術的研究。經過100多年的實踐，至19世紀中期顯微製片技術才逐漸完善。1863年W·瓦爾代爾報告了用蘇木精染色可以很好地顯示染色體。1869年E·克萊布斯最先採用石蠟作為切片支持物來包埋材料。兩年後，波姆和斯特里克勒把它發展為石蠟切片法。雖然早在1770年英國人卡明斯設計製作了切片機，但完善的轉動式切片機直到1883年才由法伊弗在美國製造成功。這些重要的製片手段仍在使用。

透射電鏡樣品製作的原理和操作與顯微製片相似。1952年G·E·帕拉德採用緩衝的四氧化鋨為固定劑獲得良好的電鏡圖象，這一方法一直在延用。1949年紐曼採用二甲烯丙酸酯作為電鏡樣品切片的介質，獲得了初步成功，後來改用了更合適的塑膠，如環氧樹脂Epon812。1953年K·R·波特和布盧姆首先採用了切超薄切片的超薄切片機，1950年拉塔和哈特曼偶然發現玻璃刀適合於超薄切片，從此玻璃刀成了電鏡切片的主要用刀，並且還在使用。當然費爾南德斯-莫蘭發明的砧石刀效果更好，並且是製作連續切片所必不可少的。1950年吉本斯和布雷德菲爾德證明電子圖象的細節可由重金屬染色而增強，從而發展了廣泛使用的電子染料。

掃描電鏡的樣品製備比較簡單。乾燥的樣品僅需金屬塗膜使樣品表面導電即可觀察。生物材料一般需要固定、脫水、乾燥和塗膜等步驟。此外，還可對所觀察的對象進行各種手術，這種在顯微鏡下操作的技術稱為顯微操作。

觀察結果

結果處理的重要性

顯微鏡及電子顯微鏡下所見顯微圖象及其顯示的信息是被觀察物體和輻射波之間相互作用的效應，有些信息是可以直接用肉眼看到和識別的，有些則不能直接看到和識別。因此對顯微技術所獲得的信息的接收、分析和處理就十分重要。

生物圖像處理技術

光學顯微鏡所觀察到的圖象可為肉眼所接受和識別。這種直接觀察的結果用描圖儀依象勾畫，即可記錄；用顯微攝影、顯微電影或錄像，則可更正確地記錄。但在電子顯微鏡發展至高解析度後，對極精細的結構，如對物質的分子或原子結構圖的接收和解釋，就會遇到許多困難，因為圖象和樣品的真實情況之間，在接收和顯示中可能發生各種誤差，不加校正和分析就無法獲得理想的圖象或作出正確的解釋。這種對電子圖象進行處理和分析的技術已發展成為一個專門的學科：生物圖像處理技術。顯微技術愈是深入的發展，圖象處理技術愈益重要。

技術套用

18～19世紀顯微技術的發展推動了生物學，特別是細胞學的迅速發展。例如，19世紀後葉細胞學家對受精作用、染色體的結構和行為的研究，就是在不斷改進顯微技術的過程中取得很大成就的，而這些成就又為細胞遺傳學的建立和發展打下了基礎。此外，顯微技術在細胞學、組織學、胚胎學、植物解剖學、微生物學、古生物學及孢粉學發展中，已成為一個主要研究手段。

電子顯微鏡的發明促使生物學中微觀現象的研究從顯微水平發展到超顯微水平。超微結構的研究結合生物化學的研究，使以形態描述為主的細胞學發展成為以研究細胞的生命活動基本規律為目的細胞生物學。

20世紀70年代以來，由於電子顯微鏡解析度的不斷提高並與電子計算機的結合套用，許多分子生物學的現象，例如DNA的轉錄、DNA分子雜交等在生物化學中用同位素技術可證實的現象，也可在電子圖象中獲得直觀的證實，許多生物大分子的結構和功能也可從電子圖象的分析中加以認識。總之，利用顯微技術進行的生物學研究可以反映細胞水平、超微結構水平，甚至分子水平三個不同的層次的信息。三者各具特點，同時又是相互聯繫和相互補充的。

在醫療診斷中，顯微技術已被用為常規的檢查方法，如對血液、寄生蟲卵、病原菌等的鏡檢等。利用顯微技術作病理的研究已發展為一門專門的學科——細胞病理學，它在癌症的診斷中特別重要。某些遺傳病的診斷，已離不開用顯微技術作染色體變異的檢查。此外，在衛生防疫、環境保護、病蟲害防治、檢疫、中草藥鑑定、石油探礦和地層鑑定、木材鑑定、纖維品質檢定、法醫學、考古學、礦物學以及其它工業材料和工業產品的質量檢查等方面，都有廣泛的套用。

技術展望

從20世紀70年代以來的發展趨勢看，顯微技術的進展將體現在以下幾個方面：

①技術上將更快地向定量顯微術方向發展；

②在儀器上不論是光學顯微鏡還是電子顯微鏡，都將從單一功能的儀器向多功能組合的大型儀器發展；

③在操作上將在更大程度上引入電子學技術，從而向更高的自動化操作發展；

④圖象分析技術將迅速地在顯微技術中廣泛的套用；

⑤設法解決在超微結構水平上作活體的觀察。曾經嘗試創製高解析度的X射線顯微鏡來觀察活體，但還沒有獲得理想的結果。