基本介紹
- 中文名：非融合蛋白
- 外文名：Non-fusion protein
- 屬於：利用大腸桿菌獲取重組蛋白的方式
- 方式：融合蛋白、非融合蛋白等
- 目的蛋白：氨基端不含任何原核多肽序列
- 例子：利用大腸桿菌重組寡聚酶
利用大腸桿菌獲取重組蛋白的方式,融合蛋白方式,非融合蛋白方式,包含體方式,
利用大腸桿菌獲取重組蛋白的方式
目前，利用大腸桿菌獲取重組蛋白的方式有融合蛋白、非融合蛋白、蛋白分泌、包含體等，每種方式都有著各自的優勢和缺陷，採用何種形式取決於重組蛋白的類型、數量和純化要求。
融合蛋白方式
這種方式是將目的基因表達為融合蛋白的一部分，即將目的蛋白融合在某些易於高效表達和純化的“融合頭”(fusionpartner)的C端。融合表達往往可以獲得目的基因的高效表達，減少蛋白酶的降解，並提供特異、簡單的純化的方法。通過化學處理或特異蛋白酶(如：凝血因子X、膠原酶、凝血酶、腸激肽酶等)水解可以切除融合蛋白N端的“融合頭”，從而獲得有生物活性的目的蛋白。研究發現，表達融合蛋白的必要條件是目的基因的閱讀框架必須與大腸桿菌原核基因的閱讀框架相符合，才能正確表達。為此，必須：(1)選擇一定的酶切位點使目的基因與表達載體中要與它相連的原核基因的序列相連線。(2)通過相互匹配的同種寡核苷酸的延伸進行連線(dA-dT或dG-dC)，由於核苷酸延伸的數目長短不一，便可形成三種閱讀框架的重組體。(3)構建成一套三種的位相載體，在插入外源基因後，三種重組質粒中保證有一種閱讀框架是正確的。(4)加上專門設計的人工合成的DNA接頭，使真核基因的閱讀框架相符合。根據以上原理方法，目前已經成功研究出多種融合表達系統，如谷胱甘肽轉移酶GST、麥芽糖結合蛋白MBP、金黃色葡萄球菌蛋白A等系統，通常都能產生高效表達的可溶性融合蛋白。
非融合蛋白方式
非融合蛋白方式表達的目的蛋白的氨基端不含任何原核多肽序列，而以該蛋白RNA的AUG為起始。為此，表達非融合蛋白的操縱子必須改建成細菌或噬菌體的啟動子-細菌的核糖體結合位點(SD序列)-目的基因的起始密碼子-結構基因-終止密碼。其中SD序列與AUG之間的距離要適當，一般3～12個核苷酸為宜。近年來，通過特定基因修飾酶(如DNA甲基化酶)的使用，結合點突變技術、PCR突變技術，可使任何一個目的基因正確地重組入非融合蛋白表達載體中進行表達。
近年來，利用非融合蛋白方式獲取重組蛋白的一個趨勢是利用大腸桿菌重組寡聚酶或寡聚蛋白。此種方法通常採用雙順反子或多順反子系統，將不同亞基的基因連同各自的SD序列串聯在一起，克隆在同一啟動子下游；或將不同亞基的表達單元，包括各自的啟動子、SD序列和結構基因串聯起來。為了防止轉錄過程中的通讀，一般在最後一個基因的3′端加上較強的轉錄終止子。表達寡聚蛋白的另一種方法是將不同亞基的基因克隆到兩個相容表達載體中，通過共轉化實現不同亞基在同一宿主中的共表達。表達後可以分別純化不同亞基，在胞外實現裝配；也可以直接純化在胞內可能組裝好的寡聚蛋白。目前，已在大腸桿菌胞內成功地表達並組裝成的寡聚蛋白有：四亞基的血紅蛋白、丙酮酸脫氫酶；三亞基的複製蛋白A，二亞基的肌球蛋白、肌酸激酶等。但一般而言，大多數重組寡聚酶或寡聚蛋白在胞內的組裝效率仍然不高。研究發現，非融合蛋白通常具有較好的可溶性，但在大腸桿菌中易被細菌蛋白酶破壞，如何克服這個不利於目前的蛋白生產的因素，還待進一步的深入研究。
包含體方式
目的基因在大腸桿菌中高效表達時，表達蛋白往往在細胞質內聚集，形成包含體(inclusionbody)。它的形成有利於防止蛋白酶對重組蛋白的降解，且非常有利於分離表達產物。但包含體形成後，重組蛋白不具生物活性。因此必須溶解包含體並對重組蛋白進行復性，通常要採用強變性劑才能溶解包含體，溶解後復性時重組蛋白體積很大，不易處理，而且復性效率很低(<20%)。包含體形成的另一個不利是負責水解起始密碼子編碼的甲硫氨酸水解酶，不能對所有重組蛋白都起作用，這就可能產生N末端帶有甲硫氨酸的重組蛋白質的衍生物，從而影響蛋白質的性質。包含體的形成不僅與重組蛋白生成率高，無足夠時間使肽鏈摺疊及重組蛋白的高濃度有關，而且與宿主菌的培養溫度、pH值、某些金屬離子不足等因素有關。近年來基於蛋白質摺疊的研究給人們提供了關於包含體如何形成的有益啟示。最近研究認為，許多蛋白質的天然構象，並不是自發地一步摺疊形成的，而是在一些輔助蛋白的協助下，經過許多中間態逐步形成的。現在已知的參與新生肽鏈摺疊的輔助蛋白有兩類：一類是指那些催化蛋白特定異構反應的酶，這些異構反應是某些蛋白質摺疊的限速步驟，稱為摺疊酶(foldase)，大腸桿菌中研究最多的摺疊酶有催化二硫鍵形成的二硫鍵異構酶DsbA，催化脯氨酸異構反應的蛋白質脯氨酸順反異構酶PPI等。
最近又發現，硫氧還蛋白還原酶TrxB的缺失突變，能增強胞內蛋白的二硫鍵形成，雖然這種突變對胞內總的氧化還原狀態影響不太。另一類輔助蛋白能保持未摺疊或部分摺疊蛋白的短暫穩定性，防止分子內或分子間不合適的相互作用，但它們並不參與任何共價反應，稱為分子伴侶(molecular chaperone)。大腸桿菌的分子伴侶主要有GroES/GroEL、DnaK/DnaJ等。按照蛋白質摺疊的上述理論，包含體的形成，起源於肽鍵摺疊過程的中間態之間的特異性的錯誤聚合，而不是形成於成熟的天然態或完全解鏈的蛋白。近年來，為了克服包含體的形成，常用的策略是在表達目的基因的同時，使適應的分子伴侶或摺疊酶基因同時表達，從而可防止表達蛋白形成包含體，且幫助表達蛋白產生正確的蛋白質摺疊。
