雷射捕獲顯微切割

雷射捕獲顯微切割：即Laser capture microdissection (LCM) technology，是在不破壞組織結構，保存要捕獲的細胞和其周圍組織形態完整的前提下，直接從冰凍或石蠟包埋組織切片中獲取目標細胞 ，通常用於從組織中精確地分離一個單一的細胞。

基本介紹

• 中文名：雷射顯微切割
• 外文名：Laser capture microdissection (LCM) 
• 專業：光、雷射生物醫療技術

背景

機體組織包含有上百種不同的細胞，這些細胞各自與周圍的細胞、基質、血管、腺體、炎症細胞或免疫細胞相互粘附。在正常或發育中的組織器官內，細胞內信號、相鄰細胞的信號以及體液刺激作用於特定的細胞，使這些細胞表達不同的基因並且發生複雜的分子變化。在病理狀態下，如果同一類型的細胞發生了相同的分子改變，則這種分子改變對於疾病的發生可能起著關鍵性的作用。然而，發生相同分子改變的細胞可能只占組織總體積的很小一部分；同時，研究的目標細胞往往被其它組織成分所環繞。為了對疾病發生過程中的組織損害進行分子水平分析，分離出純淨的目標細胞就顯得非常必要。1996年，美國國立衛生院（NIH）國家腫瘤研究所的[2]開發出雷射捕獲顯微切割技術（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美國Arcturus Engineering公司成功研製雷射捕獲顯微切割系統，並實現商品化銷售。套用該技術可以在顯微鏡直視下快速、準確獲取所需的單一細胞亞群，甚至單個細胞，從而成功解決了組織中細胞異質性問題。這項技術現已成為美國“腫瘤基因組解剖計畫”的一項支撐技術。

搭配倒置螢光顯微鏡及數碼成像系統

原理

LCM的基本原理是通過一低能紅外雷射脈衝激活熱塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰接近紅外雷射波長），在直視下選擇性地將目標細胞或組織碎片粘到該膜上。LCM 系統包括倒置顯微鏡、固態紅外雷射二極體、雷射控制裝置、控制顯微鏡載物台（固定載玻片）的操縱桿、電耦合相機及彩色顯示器。用於捕獲目標細胞的熱塑膜直徑通常為6mm，覆在透明的塑膠帽上，後者恰與後繼實驗所用的標準 0.5ml離心管相匹配。

機械臂懸掛控制覆有熱塑膜的塑膠帽，放到脫水組織切片上的目標部位。顯微鏡直視下選擇目標細胞，發射雷射脈衝，瞬間升溫使 )EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜滲透到切片上極微小的組織間隙中，並在幾毫秒內迅速凝固。組織與膜的粘合力超過了其與載玻片間的粘合力，從而可以選擇性地轉移目標細胞。雷射脈衝通常持續0.5~5.0毫秒，並且可在整個塑膠帽表面進行多次重複，從而可以迅速分離大量的目標細胞。將塑膠帽蓋在裝有緩衝液的離心管上，將所選擇的細胞轉移至離心管中，從而可以分離出感興趣的分子進行實驗。

EVA膜約100~200μm厚，能夠吸收雷射產生的絕大部分能量，在瞬間將雷射束照射區域的溫度提高到90°C，保持數毫秒後又迅速冷卻，保證了生物大分子不受損害。採用低能量紅外雷射的同時也可避免損傷性光化學反應的發生。

雷射顯微切割光路圖

觸控屏直接選擇切割區域

LCD優缺點

LCM最顯著的優點在於其迅速、準確和多用途的特性。結合組織結構特點以及所需的切割精確度，通過選擇雷射束的直徑大小，可以迅速獲取大量的目標細胞。LCM與以顯微操作儀為基礎的顯微切割技術相比，具有以下優點：(1)分離細胞速度快，無需精巧的操作技能；(2)捕獲細胞和剩餘組織的形態學特徵均保持完好，可以較好地控制捕獲細胞的特異性；(2) 捕獲細胞與塑膠帽結合緊密，減少了組織損失的風險。相比而言，除了雷射切割彈射微分離系統以經染色的用於存檔的切片也可被成功進行顯微切割。

儘管 LCM 套用廣泛，但對於常規染色、固定且不加蓋玻片的組織切片，其視覺解析度受到很大限制。而對於那些本身缺乏一定結構特點的複雜組織（如淋巴組織，廣泛浸潤的腺癌等），要準確分離出某一類細胞幾乎是不可能的。Fend等通過採用特殊染色，尤其是免疫組化方法，使目標細胞或想要去除的細胞變得更加醒目，從而解決了上述難題。

套用 LCM，偶爾會出現無法將選擇的細胞從切片上移走的情況，出現這種結果有兩種原因：(1) 細胞與熱塑膜之間的粘合力不足，通常是由於組織未完全脫水或雷射的能量設定過低造成的；(2)組織切片與載玻片間的粘合力過強，通常發生在顯微切割乾燥時間過長的冰凍切片。針對不同樣本組織（包括免疫組化染色的組織切片），一些研究小組分別詳盡報導了採用適合的處理方法，以達到最佳的顯微切割條件。

套用

LCM較以往的顯微切割技術有了突破性的進展，現已廣泛套用於腫瘤研究，包括前列腺癌、腎癌、肺癌、甲狀腺癌、食管癌 、胃癌、肝癌、膽管癌、結腸癌 、乳腺癌、膠質瘤 、惡性胸膜間皮瘤、淋巴瘤、卵巢癌等。此外，LCM還成功套用於其它一些疾病的研究中，如Crohn病 、肌萎縮性側索硬化症 、子宮內膜異位症、獲得性免疫缺陷綜合徵、結核病、C型肝炎等。而套用LCM所分離的組織也多種多樣，包括單個細胞、單一細胞群（主要是癌巢）、血管等類型。

雷射捕獲顯微切割與生物晶片的結合套用

展 望

LCM成功解決了組織異質性問題，且具有迅速、準確等諸多優點，已被廣泛套用於腫瘤等疾病基因水平的研究中，並顯示出了良好的套用前景。但今後可能還需要以下幾個主要方面的發展和完善：理論上，除上述組織及細胞以外，LCD還可套用於其他所有組織細胞（如脾臟巨噬細胞、肝臟Kuffer細胞等）的分離，但其各自的切片製備、染色等技術方法尚需要進行探索；開發相應的應用程式，僅需輸入目標細胞或組織的特異性參數即可實現計算機自動控制LCD，從而大大縮減所需的人力和時間；提高捕獲單個細胞的精確度，以減少非目標組織的沾染；進一步最佳化快速免疫組化染色的步驟，改進DNA和 RNA抽提技術，實現從少量捕獲細胞或組織中獲得高質量的核酸。