《雜合抗菌抗病毒肽設計及其工程菌構建和作用效應研究》是依託中國農業大學，由張日俊擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：雜合抗菌抗病毒肽設計及其工程菌構建和作用效應研究
- 依託單位：中國農業大學
- 項目負責人：張日俊
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
針對阻礙畜牧業可持續發展的瓶頸問題，如長期超量使用抗生素產生的耐藥性、藥殘和環境污染問題，以及由變異、非典型病毒等引發的多種畜禽疾病而造成的巨大經濟損失。本項目利用生物信息聯合資料庫中的抗菌肽序列資源和本實驗室研究基礎，設計新型雜合抗菌抗病毒肽（AMVP），人工化學合成並篩選出高效雜合AMVP，然後分別構建出高效表達雜合AMVP的工程菌，然後進行高效表達和分離純化，並進一步研究其生物學特性（抗菌、抗病毒、穩定性等）和抗菌抗病毒機理以及對肝、腎等組織細胞和免疫功能的影響，為研究新型雜合抗菌肽類乃至其它生物活性肽的分子設計、篩選、表達、分離純化、功效評價、作用機制研究提供系統和公用的新思路、新技術和新方法等，最終為研發新型雜合肽類抗生素替代品、綠色生物藥物等開闢一條新途徑、以確保人類的食品安全和健康。
結題摘要
抗菌肽是通過核糖體途徑產生的具有抗菌活性的多肽和蛋白類物質。相對於通過酶促反應形成的抗生素，抗菌肽具有安全性高、無殘留、高穩定、特異性抑殺病原菌等優良特性，是抗生素替代品的理想選擇。本研究利用 APD 等多個資料庫中抗菌肽相關信息資源並結合本實驗室研究基礎，以具有高效抗菌和（或）抗病毒活性的抗菌肽 melittin、 cecropin A、 LL-37、 HP（ 2-20）、 lacticin Q 為母源肽，設計、篩選併合成了六條具有潛在抗菌活性的候選雜合肽。通過對母源肽和候選雜合肽的生物活性研究，篩選得到具有高效抗菌抗病毒活性的抗菌抗病毒雜合肽 M-L 和 C-L。雜合肽 M-L和 C-L 抑菌活性較母源肽提高 2-64 倍，殺菌速度得到不同程度的改善；溶血試驗發現，雜合肽均未表現出明顯的溶血活性，溶血性較母源肽降低了 1-16 倍。本項目還對M-L和 C-L在兩種不同表達系統的表達方法、生物學特性和免疫調節效果研究。結果表明，成功在畢赤酵母和大腸桿菌中進行了C-L和 M-L的高效表達。在畢赤酵母表達中，分別將雜合肽C-L和 M-L基因與pPICZaA載體連線，構建重組載體，轉化畢赤酵母GS115，重組雜合肽經過純化，獲得了純度90%以上的重組雜合肽，產量分別為50.84 和45.5 mg/L。且C-L的畢赤酵母工程菌經過規模培養及條件最佳化，達到規模生產水平。在大腸桿菌表達中，分別將C-L和 M-L基因克隆到pET SUMO質粒構建表達載體，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，使細菌素與SUMO融合表達，經IPTG誘導，融合細菌素實現了胞內表達，通過酶切及兩輪Ni-NTA Sepharose色譜柱純化獲得了純度90％以上的重組細菌素，產量可分別高達23、17.54 mg/L。除此之外，本項目對C-L進行了抗炎特性的研究,結果表明，雜合肽C-L能夠有效的抑制LPS誘導的炎症因子表達量，並能通過NFKB及MAPK信號通路調節機體免疫反應。以上研究結果表明，本項目成功進行了重組雜合肽在兩種載體的高效表達，且具有良好的抑菌活性、較寬的pH、高溫耐受性和抗炎效應。C-L和 M-L高效表達和純化為重組細菌素或抗菌肽的高效表達和純化提供了具體的表達系統、表達方法、參數和理論依據，而且為抗生素替代品的開發提供了新思路、新方法、新技術。
