《高產廣譜細菌素工程菌的構建表達和特性研究》是依託中國農業大學，由張日俊擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：高產廣譜細菌素工程菌的構建表達和特性研究
- 依託單位：中國農業大學
- 項目負責人：張日俊
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
在前期研究基礎上，為解決前期篩選的野生菌株產生的細菌素分離純化困難和產量低的問題，本項目擬利用已知的益生菌來源的高效廣譜細菌素的基因序列，通過切割、拼接、序列胺基酸替代和修飾、組合（雜合）等方法，人工設計合成抗菌活性更強、抗菌譜更廣、但不抑制腸道優勢菌群（如乳酸菌）的新型細菌素基因，然後將新基因克隆表達於畢赤酵母中，成功構建出高產高活性廣譜細菌素的工程菌，最佳化誘導表達和培養條件，獲得高產量高活性的細菌素，經分離純化獲得高純度細菌素，進一步研究其抗菌特性、生化特性（穩定性）以及對豬禽的套用效果。項目的完成極有可能探索出設計開發新型細菌素的新方法和新思路，進而為開發畜禽和水產用抗生素替代品乃至為開發新型生物醫藥、新型食品生物防腐劑、植物生防劑提供公用新方法、新技術；也為其它細菌素工程菌的構建奠定理論和技術基礎。
結題摘要
細菌素是由細菌通過核糖體途徑產生的具有抗菌活性的肽和蛋白類物質。相對於通過酶促反應形成的抗生素，細菌素具有安全性、無殘留、高穩定、特異性抑殺病原菌等優良特性，是抗生素替代品的理想選擇。細菌素lacticin Q（簡稱LQ）和 bacteriocin E50-52（簡稱BE50-52）具有抗菌活力高、益生菌來源、特異性抑殺病原菌、pH和高溫耐受性好等優良特性。本項目主要進行LQ和 BE50-52在三種不同表達系統的表達方法、生物學特性和動物套用效果研究。結果表明，成功在畢赤酵母和大腸桿菌中進行了LQ和 BE50-52的高效表達，在枯草芽孢桿菌中進行了LQ的高效表達。在畢赤酵母表達中，分別將細菌素LQ和 BE50-52基因與pGAPZaA載體連線，構建重組載體，轉化畢赤酵母SMD1168，重組細菌素經超濾、反相色譜及分子篩層析等純化，獲得了純度90%以上的重組細菌素，產量分別為0.9 和1.1 mg/L。在大腸桿菌表達中，分別將LQ和 BE50-52基因克隆到pET SUMO質粒構建表達載體，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，使細菌素與SUMO融合表達，經IPTG誘導，融合細菌素實現了胞內表達，通過酶切及兩輪Ni-NTA Sepharose色譜柱純化獲得了純度95％以上的重組細菌素，產量可分別高達32、16 mg/L。在枯草芽孢桿菌表達中，套用分子伴侶（SUMO）技術，將融合SUMO-LQ基因克隆到pWB980質粒構建表達載體，轉化枯草芽孢桿菌宿主WB600，實現了LQ的組成型分泌表達，經兩輪Ni-NTA Sepharose色譜柱純化後可得純度93%以上重組LQ，產量為5.3 mg/L。以上研究結果表明，本項目成功進行了重組細菌素在三種載體的高效表達。而且特性分析表明，純化後的重組細菌素分子量與理論分子量一致，對金黃色葡萄球菌等指示菌具有良好的抑菌活性，具有較寬的pH和高溫耐受性；動物試驗表明，重組細菌素能夠顯著降低(p＜0.05)金黃色葡萄球菌引起的小鼠炎性反應，有較好的抑菌活性。LQ和 BE50-52高效表達和純化為重組細菌素或抗菌肽的高效表達和純化提供了具體的表達系統、表達方法、參數和理論依據，而且為抗生素替代品的開發提供了新思路、新方法、新技術。
