基本介紹
- 中文名：隱秘質粒
- 外文名：cryptic plasmid
- 屬於：質粒
- 特點：不顯示任何表型效應
- 檢測：物理化學方法
- 例如：凝膠電泳檢測細胞提取液
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隱秘質粒的定義
質粒的主要類型有致育因子（fertility factor，F因子）、抗性因子（resistance factor，R因子）、產細菌素的質粒（bacteriocin producing plasmid）、毒力質粒（virulence plasmid）、代謝性質粒（metabolic plas－mid）、隱秘質粒（cryptic plasmid）等。隱秘質粒不顯示任何表型效應，他們的存在只有通過物理化學方法才能發現，例如凝膠電泳檢測細胞提取液等方法。
大腸桿菌Nissle 1971隱秘質粒消除
大腸桿菌Nissle 1971隱秘質粒
大腸桿菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle1917，EcN）是由Alfred Nissle於1917年分離的優質益生菌，現今作為益生製劑廣泛套用於臨床，主要治療腹瀉、炎症性腸炎以及便秘等。該益生菌具有多方面的優良性能，其對宿主安全，不含腸毒素、溶血毒素和細胞毒素等致病性因子。EcN也越來越多地套用於疫苗、疾病診斷及藥物研發的研究當中，有研究報導EcN能在腫瘤特異性定殖，因而可用於實體瘤診斷的臨床研究中，並且其具有作為運送載體對腫瘤進行治療的潛在套用價值。EcN本身攜帶2個隱秘大質粒pMUT1和pMUT2，有研究報導pMUT1帶有ColE1類型複製系統，pMUT2含有類ColE2複製系統，但目前對其生物學意義了解較少。為了使EcN更好地套用於大腸桿菌工程菌的基因轉化、表達作業系統，我們擬構建無質粒EcN菌株。
常見的質粒去除技術包括使用化學方法、物理方法及分子生物學方法。化學方法可以用一定濃度的表面活性劑SDS、嵌合染料、抗生素或中藥等處理。物理方法有逐級高溫法、紫外線照射、電穿孔、原生質體形成與再生等。化學和物理方法或多或少存在質粒去除不理想的情況，且對宿主菌生物學性狀產生較大影響。分子生物學方法包括使用轉座子消除質粒和利用質粒不相容性消除質粒等方法，利用轉座子構建的過程及篩選所需轉座標記菌株較繁瑣，也易出現假陽性結果。
EcN隱秘質粒pMUT1的去除
電轉化
製備EcN電轉化感受態細胞，使用pMUT1－pRE112重組質粒DNA電轉化該感受態細胞，加入1mL無抗性SOC培養基，37℃搖床振盪培養45min，塗布Cm+LB平板（30mg/L）培養過夜。
篩選陽性克隆
挑取單菌落接種Cm+LB液體（30mg/L），37℃搖床振盪培養16～18h，提取重組質粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳鑑定篩選出攜帶重組質粒pMUT1－pRE112的EcN菌株（EcN/pMUT1－pRE112）。
去除pMUT1質粒
將EcN/pMUT1－pRE112在Cm+LB液體（30mg/L）培養1代後，在Cm+LB固體（30mg/L）上盲傳3代。重新挑單菌落擴大培養提取質粒DNA和電泳鑑定獲取去除pMUT1質粒但攜帶重組質粒pMUT1－pRE112的EcN菌株（EcNΔpMUT1/pMUT1－pRE112）。
去除pMUT1－pRE112質粒
含10%蔗糖LB液體培養EcNΔpMUT1/pMUT1－pRE112，然後在含10%蔗糖LB平板上培養，盲傳3代，溫度均為30℃，挑取單菌落同時劃線於LB和Cm+LB平板（30mg/L），選取氯黴素抗性敏感菌擴大培養提取質粒DNA和電泳鑑定pMUT1－pRE112去除情況。
