DiBAC4(3)是一種細胞膜電位敏感的親脂性陰離子螢光染料，DIBAC4(3)本身無螢光，當進人細胞與胞漿內的蛋白質結合後才發出螢光，DIBAC4(3)進入細胞，細胞內螢光強度增加，即膜電位增加表示細胞去極化；反之，細胞內螢光強度降低即膜電位降低表示細胞超極化。DiBAC4(3)是目前最常用的線粒體膜電位檢測螢光探針。
基本介紹
- 中文名：鈣離子螢光探針
- 顏色及形狀：橘紅色液體
- 純度：大於95%（高效液相）
- 溶解性：溶於DMSO
- 消散係數：86000/Mcm(506nm)
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套用詳解
理化性質
吸收波長/發射波長：506nm /526nm(低/高鈣)
保存與使用：粉狀的FLUO-3AM應保存於-20度以上。建議使用DMSO作為溶媒。在溶解前，FLUO-3AM和DMSO均須放置至室溫。溶解過程可能會比較慢。用無水的DMSO溶解的FLUO-3AM長期保存，應嚴格密封，並保存於-20度。使用前，將保存液放置至室溫後再打開。可避免AM探針在長期的保存過程中水解。
工作原理
FLUO-3廣泛用於長波長的螢光鈣指示劑。其在506NM處被吸收，可以被氬離子雷射的488nm激發光激發，便於檢測。FLUO-3在沒有同鈣結合的情況下，無螢光產生。但是，在與鈣結合後，螢光（526nm）增強至少40倍。Fluo-3 AM是一種可以穿透細胞膜的螢光染料。Fluo-3 AM的螢光非常弱，其螢光不會隨鈣離子濃度升高而增強。Fluo-3 AM進入細胞後可以被細胞內的酯酶剪下形成Fluo-3，從而被滯留在細胞內。Fluo-3可以和鈣離子結合，結合鈣離子後可以產生較強的螢光，最大激發波長為506nm，最大發射波長為526nm。實際檢測時推薦使用的激發波長為488nm左右，發射波長為525-530nm。
產品套用
1、過程概述
用於細胞內鈣離子檢測時，Fluo-3 AM的常用濃度為5μM。通常用含有5μM的Fluo-3 AM的適當溶液和細胞一起在37℃孵育30-60分鐘進行螢光探針裝載，隨後適當洗滌，洗滌後可以考慮適當再孵育20-30分鐘以確保Fluo-3 AM在細胞內完全轉變成Fluo-3。然後在流式細胞儀上進行檢測。
2、Fluo-3AM使用液的配置
100ug的Fluo-3AM，分子量是1219.9。按實際需要的摩爾濃度折算，無水DMSO溶解。一般配置成1~5mM的DMSO儲存液。如出現難溶現象，可以用20%的F127的DMSO溶液助溶。
四、注意事項：
1、螢光染料有淬滅問題，應儘量避光保存；
2、實驗時注意個人防護，戴手套、口罩；
五、套用舉例
2、貯存液的配製（5000μM/L）
按照說明書，計算0.1mg 的摩爾數為0.089μM ，則需加DMSO18uL，微量加樣器反覆吹打混勻後分裝，按說明書要求避光-20度冰凍保存。
（二）應用
每毫升細胞懸液中加入1 uL，則Fluo-3AM的使用終濃度為5μM/L
Hoechst 33258染色
固定液 50 ml
Hoechst 33258染色液 50 ml
抗螢光淬滅封片液 5 ml
說明書 1 份
保存條件：
4℃保存，Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。本試劑盒自訂購之日起六個月內有效。
注意事項：
Ø 需螢光顯微鏡或雷射共聚焦顯微鏡。
Ø 需PBS或0.9%NaCl溶液。
Ø 需蓋玻片與載玻片。
Ø 螢光物質均易發生淬滅，染色後的樣品宜避光保存。
Ø 在使用抗淬滅封片液的情況下可以減緩淬滅，但仍宜儘量避光。
使用說明
1. 貼壁細胞
A. 取普通潔淨蓋玻片於70%乙醇中浸泡5分鐘或更長時間，無菌超淨台內吹乾或用細胞培養級PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌三遍，再用細胞培養液洗滌一遍。將蓋玻片置於六孔板內，種入細胞培養過夜，使約為50%-80%滿。
B. 刺激細胞發生凋亡後，吸盡培養液，加入0.5ml固定液，固定10分鐘或更長時間（可4℃過夜）。
C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動數次。
D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘。也宜用搖床，或手動晃動數次。
E. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。
F. 滴一滴抗螢光淬滅封片液於載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，儘量避免氣泡。使細胞接觸封片液，切勿弄反。
G. 螢光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發波長在350nm左右，發射波長在460nm左右，詳細圖譜請參考下圖。
懸浮細胞
A. 離心收集細胞樣品於1.5ml離心管內，加入0.5ml固定液，緩緩懸起細胞，固定10分鐘或更長時間（可4℃過夜）。
B. 離心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。洗滌期間手動晃動。
C. 最後一次離心後吸去大部分液體保留約50ml液體，再緩緩懸起細胞，滴加至載玻片上，儘量使細胞分布均勻。
D. 稍晾乾，使細胞貼在載玻片上不易隨液體流動。
E. 均勻滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體，微晾乾。
F. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。
G. 滴一滴抗螢光淬滅封片液於載玻片上，蓋上一潔淨的蓋玻片，儘量避免氣泡。
H. 螢光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發波長在350nm左右，發射波長在460nm左.
3
組織切片
A. 對於任何常見切片，處理至常規可以進行免疫染色時，或完成常規的免疫染色後，即可進行後續的Hoechst染色。
B. PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動數次。可在六孔板中操作。
C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分鐘。也宜用搖床，或手動晃動。
D. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍，每次3分鐘。
E. 將切片置於載玻片上，滴一滴抗淬滅封片液，蓋上一潔淨的蓋玻片，儘量避免氣泡。
F. 螢光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發波長在350nm左右，發射波長在460nm左右，
Hoechst 33258的吸收光譜和發射光譜，左側峰為吸收光譜，右側峰為發射光譜。
DAPI染核
產品原理
主要結合dsDNA；結合小溝的AT。DAPI也結合RNA，但其發射峰波長（500nm）要長於DAPI/dsDNA（460nm）。
DAPI dilactate更水溶。在用於組織染色、未固定細胞和組織染色時，下述方法可加以修改。
保存：
10mg/單位，室溫避光保存，小瓶內至少一年。制stock液，溶解100uM （DAPI dihydrochloride二鹽酸化物分子量為350.3；DAPI dilactate分子量為457.5）DAPI於去離子水中或DMF(二甲基甲醯胺)，4℃避光可保存6個月。
DAPI是誘變劑，水溶液可通過活性炭去除，要安全處理。
染色：
在所有染色完成後進行復染，不需要另外的固定和通透處理。
復染方法
1. PBS平衡
2. PBS稀釋DAPI stock液至300nM，滴加300μL這種稀釋液於細胞上。
3. 孵育5分鐘。
4. PBS中涮洗幾次，涳乾過量緩衝液，抗淬滅劑封片。
FISH復染：
樣品在dH2O中洗以去除殘留緩衝鹽溶液，有助於減少玻片上非特異背景。
1. PBS中稀釋至30nM，吸300μL滴於樣品上，塑膠玻片有助於平均分配染料。
2. 黑暗室溫孵育30分鐘。
3. 去掉蓋玻片，PBS和dH2O中小心盥洗。
4. 去掉過量液體，綿紙在樣品邊緣小心吸取。
5. 蓋上蓋玻片，蠟或指甲油封片。或按供應商的指導加抗淬滅劑。
螢光顯微鏡觀察。
Rhodamine 123 染色
中文名稱：羅丹明 123
目 的：測細胞內線粒體的跨膜電位
EX/EM： 505/534
染液配製： 羅丹明123 粉劑用甲醇配製成1mg/ml的儲備液，100ul/支分裝，-20℃保存。染色時用Dulbecco’s PBS緩衝液將其稀釋為5ug/ml。
染色步驟：
培養細胞
Dulbecco’s PBS緩衝液漂洗2～3次(緩衝液預熱至室溫或37℃)
Rhodamine 123(5ug/ml) 37℃孵育1小時
Dulbecco’s PBS緩衝液漂洗2～3次
加0.5ml Dulbecco’s PBS，上機測量
Fluo-3-AM 染色 (測細胞內游離鈣離子濃度)
染液配製：Fluo-3-AM 50ug溶於45ul DMSO(Fluo-3-AM濃度 1mM)，15ul/支分裝，-20℃保存。染色時用15～50mM HEPES緩衝液將其稀釋為1～20uM(如1.5ml 為10uM)。
染色步驟：
培養細胞
緩衝液漂洗2～3次
Fluo-3-AM (1～20uM) 37℃或室溫孵育0.5～1小時
緩衝液漂洗2～3次
加0.5ml 緩衝液，上機測量。
