本書針對新形勢下醫學遺傳學教材改革目標的要求，為適應新形勢下學科教學任務而編寫。全書共分4篇、18章，全書以群體、家系、個體、細胞、分子為切入點，把基因、染色體的遺傳作為一個整體、二個系統來描述編寫，並且強調其在臨床疾病的診斷、治療中的套用，還著重闡述了分子遺傳學的理論與技術。 本書可供高等醫學院校臨床醫學(五年制、七年制)、口腔醫學、預防醫學、法醫學、護理學(五年制)學生使用。
基本介紹
- 書名：醫學遺傳學/上海普通高校九五重
- 類型：醫學
- 出版日期：2001年1月1日
- 語種：簡體中文
- ISBN：7543917599
- 作者：陸振虞
- 出版社：上海科學技術文獻出版社
- 頁數：416頁
- 開本：16
- 品牌：上海科學技術文獻出版社
媒體推薦,圖書目錄,文摘,
媒體推薦
序
上海第二醫科大學是國內最早成立醫學遺傳學教研室的高等醫學院校之一。由該教研室編著的《醫學遺傳學》修訂第3版即將出版了。主編陳仁彪和馮波教授邀我作序，深感慰藉。
童致棱教授是上海第二醫科大學生物學教研室的創建人，早在20世紀毛60年代初，他就注意到醫學遺傳學的興起，並開始著手培養教師，70年代中期，他又分派教師投入人體白細胞抗原(HLA)研究，邁出了開創國內免疫遺傳學研究的第一步。在黨的十一屆三中全會改革開放精神的鼓舞下，上海第二醫科大學生物學教研室沿著童致棱教授開創的軌跡，於19r78年部分教師和技術人員獨立組建免疫遺傳學研究室，接著1985年又有部分教師和技術人員從生物學教研室分化出來成立醫學遺傳學教研室。由童致棱教授創建的上海第二醫科大學生物學教研室為中國高等醫學院校醫學遺傳學學科建設作出了貢獻。
上海第二醫科大學醫學遺傳學教研室成立以來，艱苦創業，致力於醫學遺傳學的教學與科研工作，取得了豐碩的成果。他們發揮教研室的集體力量，不斷積累資料，及時修訂教材。目前，已有20餘所高等醫學院校採用了他們編寫的《醫學遺傳學》第1、2版教材，使用後均給予好評。
醫學遺傳學經過近半個世紀的發展，已經成為一門涉及數千種遺傳性疾病的基礎理論和臨床實踐的科學。當前分子醫學遺傳學正在強有力地推動著分子遺傳醫學的發展，隨著時間的推移必將證明，當今時代正是分子醫學遺傳學發展的黃金時代。在這種背景下，本書作者們為高等醫學院校醫學遺傳學的教學提供了一本既著重闡述基本原理又提示發展前景的教材，反映了當代醫學遺傳學的最新成果。本書按最新的概念，將遺傳性疾病由三類擴展為五類，首次寫出獨立的一章《線粒體基因病》。本書還對親代印跡、三核苷酸重複順序多態性、遺傳早現等新發現作了簡明扼要的介紹。本書特別注意基本原理和分子水平成果的介紹，如致病基因突變、基因診斷、基因治療等。因此，本書可以是從醫學本科生學習到研究生學習的橋樑，從經典醫學遺傳學到分子醫學遺傳學的橋樑，從基礎醫學到臨床醫學的橋樑。
醫學遺傳學正在飛速發展。一門課程的課時是有限的，而未來遺傳醫學專家為病人提供遺傳醫學服務則是一輩子的任務。醫學生不僅要學習當前醫學遺傳學的基本原理，而且還應該掌握醫學遺傳學領域新概念、新技術，以及它們相繼湧現時如何繼續學習，以便跟上科學發展的步伐，為病人提供日益精良的醫療服務。本書可以為此提供學習的導引。
醫學遺傳學正在發展成為一門高技術的科學，其理論的高深和技術的複雜增加了醫生與病人交換思想的難度，使兩者之間產生距離。對未來遺傳醫學專家的挑戰之一是如何使遺傳醫學的高技術更好地服務於正在與遺傳病搏鬥或受到遺傳病威脅的病人。醫學遺傳學的發展，無論是過去、現在還是未來，都要歸功於醫學遺傳學家和遺傳病患者雙方的科學獻身精神。要像俄羅斯的一句格言所說：“讓你的頭腦充滿愛心，讓你的內心充滿智慧。”
未來的醫學需要遺傳醫學專家。我願本書引導醫學生步入醫學遺傳學的殿堂。
劉祖洞
復旦大學遺傳學研究所
1993年10月30日
上海第二醫科大學是國內最早成立醫學遺傳學教研室的高等醫學院校之一。由該教研室編著的《醫學遺傳學》修訂第3版即將出版了。主編陳仁彪和馮波教授邀我作序，深感慰藉。
童致棱教授是上海第二醫科大學生物學教研室的創建人，早在20世紀毛60年代初，他就注意到醫學遺傳學的興起，並開始著手培養教師，70年代中期，他又分派教師投入人體白細胞抗原(HLA)研究，邁出了開創國內免疫遺傳學研究的第一步。在黨的十一屆三中全會改革開放精神的鼓舞下，上海第二醫科大學生物學教研室沿著童致棱教授開創的軌跡，於19r78年部分教師和技術人員獨立組建免疫遺傳學研究室，接著1985年又有部分教師和技術人員從生物學教研室分化出來成立醫學遺傳學教研室。由童致棱教授創建的上海第二醫科大學生物學教研室為中國高等醫學院校醫學遺傳學學科建設作出了貢獻。
上海第二醫科大學醫學遺傳學教研室成立以來，艱苦創業，致力於醫學遺傳學的教學與科研工作，取得了豐碩的成果。他們發揮教研室的集體力量，不斷積累資料，及時修訂教材。目前，已有20餘所高等醫學院校採用了他們編寫的《醫學遺傳學》第1、2版教材，使用後均給予好評。
醫學遺傳學經過近半個世紀的發展，已經成為一門涉及數千種遺傳性疾病的基礎理論和臨床實踐的科學。當前分子醫學遺傳學正在強有力地推動著分子遺傳醫學的發展，隨著時間的推移必將證明，當今時代正是分子醫學遺傳學發展的黃金時代。在這種背景下，本書作者們為高等醫學院校醫學遺傳學的教學提供了一本既著重闡述基本原理又提示發展前景的教材，反映了當代醫學遺傳學的最新成果。本書按最新的概念，將遺傳性疾病由三類擴展為五類，首次寫出獨立的一章《線粒體基因病》。本書還對親代印跡、三核苷酸重複順序多態性、遺傳早現等新發現作了簡明扼要的介紹。本書特別注意基本原理和分子水平成果的介紹，如致病基因突變、基因診斷、基因治療等。因此，本書可以是從醫學本科生學習到研究生學習的橋樑，從經典醫學遺傳學到分子醫學遺傳學的橋樑，從基礎醫學到臨床醫學的橋樑。
醫學遺傳學正在飛速發展。一門課程的課時是有限的，而未來遺傳醫學專家為病人提供遺傳醫學服務則是一輩子的任務。醫學生不僅要學習當前醫學遺傳學的基本原理，而且還應該掌握醫學遺傳學領域新概念、新技術，以及它們相繼湧現時如何繼續學習，以便跟上科學發展的步伐，為病人提供日益精良的醫療服務。本書可以為此提供學習的導引。
醫學遺傳學正在發展成為一門高技術的科學，其理論的高深和技術的複雜增加了醫生與病人交換思想的難度，使兩者之間產生距離。對未來遺傳醫學專家的挑戰之一是如何使遺傳醫學的高技術更好地服務於正在與遺傳病搏鬥或受到遺傳病威脅的病人。醫學遺傳學的發展，無論是過去、現在還是未來，都要歸功於醫學遺傳學家和遺傳病患者雙方的科學獻身精神。要像俄羅斯的一句格言所說：“讓你的頭腦充滿愛心，讓你的內心充滿智慧。”
未來的醫學需要遺傳醫學專家。我願本書引導醫學生步入醫學遺傳學的殿堂。
劉祖洞
復旦大學遺傳學研究所
1993年10月30日
圖書目錄
序 (第1版)
前言 (第1版)
序 (笫2版)
前言 (第2版)
第一章 遺傳學與醫學
第一節 健康與疾病的遺傳基礎
第二節 醫學遺傳學發展簡史
第三節 遺傳性疾病的分類
第四節 醫學遺傳學和人類基因組研究
第二章 遺傳物質的結構、功能和變異
第一節 遺傳物質的結構
一、DNA的雙螺旋結構
二、染色質和染色體的結構
三、基因和基因組
第二節 遺傳信息的複製和表達
一、DNA的複製和遺傳信息的傳遞
二、核基因的傳遞規律
三、基因的結構和基因的表達
第三節 DNA變異與遺傳性疾病
一、基因突變
二、基因組的多態性
第三章 人類致病基因的研究策略與方法
第一節 識別致病基因的原則和策略
第二節 定位非依賴性基因克隆策略
一、蛋白質導向的致病基因克隆
二、DNA順序導向的致病基因克隆
三、基因功能導向的致病基因克隆
第三節 定位克隆
第四節 定位候選基因克隆
第五節 候選基因的證實
第四章 人類染色體和染色體病
第一節 人類染色體的結構、形態及分類
……
前言 (第1版)
序 (笫2版)
前言 (第2版)
第一章 遺傳學與醫學
第一節 健康與疾病的遺傳基礎
第二節 醫學遺傳學發展簡史
第三節 遺傳性疾病的分類
第四節 醫學遺傳學和人類基因組研究
第二章 遺傳物質的結構、功能和變異
第一節 遺傳物質的結構
一、DNA的雙螺旋結構
二、染色質和染色體的結構
三、基因和基因組
第二節 遺傳信息的複製和表達
一、DNA的複製和遺傳信息的傳遞
二、核基因的傳遞規律
三、基因的結構和基因的表達
第三節 DNA變異與遺傳性疾病
一、基因突變
二、基因組的多態性
第三章 人類致病基因的研究策略與方法
第一節 識別致病基因的原則和策略
第二節 定位非依賴性基因克隆策略
一、蛋白質導向的致病基因克隆
二、DNA順序導向的致病基因克隆
三、基因功能導向的致病基因克隆
第三節 定位克隆
第四節 定位候選基因克隆
第五節 候選基因的證實
第四章 人類染色體和染色體病
第一節 人類染色體的結構、形態及分類
……
文摘
書摘
第一節 識別致病基因的原則和策略
人類基因組含有30億個鹼基對，其中編碼順序僅占不足2%。根據2001年2月公布的人類基因組精細圖譜，人類基因數量約為3．5萬個。遠較以往估計的基因數量少。基因結構的變異或突變勢必造成基因表達產物結構、基因表達調控或轉錄本剪下方式的改變，其中部分基因結構和功能的改變最終導致人類疾病表型的發生。由表型追蹤到基因型的過程就是致病基因或疾病易感基因定位、克隆的過程。在過去幾十年當中，這一過程常以年或數十年計。自20世紀80年代以來，由於：PCR技術在連鎖分析和突變掃描中的套用使這一過程大為縮短，尤其是人類基因組信息的積累，基因圖譜、克隆、DNA順序、表達譜和表型資料等的綜合套用，使疾病基因的克隆過程縮短為數星期。在浩瀚的基因組中分離或克隆某一特定基因並對其功能進行系統深入的研究，對完全理解正常或異常表型與其相應基因型之間的關係至關重要。對克隆到的基因進行DNA測序分析有助於闡明基因表達產物在正常生理條件下的功能，突變如何導致該基因產物異常或缺失，不同外顯子發生不同類型的突變對疾病影響的程度等。在此基礎上，一系列實驗技術和方法對闡明基因功能、蛋白質之間的相互作用，突變基因如何干擾細胞內正常生化通路等是必不可少的。根據正常或突變基因順序分析的結果可以建立特異性突變基因的診斷方法；對基因功能的認識又為遺傳病的治療，包括基因治療奠定基礎。
複製人類致病基因的確是一個繁複的系統工程，如果將這一過程形容為“大海撈針”也不為過。以荒島尋寶的過程為例，在未知島嶼上探尋寶藏就如同發現人類致病基因。在有些情況下，寶物貯藏的地點還不止一處。該如何著手尋寶?如果將各方面的信息綜合分析足以明確寶藏所在的島嶼，隨著探導工作的深入，新的信息將會引導尋寶人最終發現真正的寶藏，即功能基因克隆。另一種情況是已知信息使尋寶人對可能藏匿寶物的島嶼提出某種假設，然後集中力量在可能有寶藏的島嶼上搜尋，最終有可能獲得期望的結果，即候選基因克隆。，但意外情況時有發生，在提出充分證據、合理可靠的推測或假設後，仍有可能在錯誤的島嶼上掘地三尺或得到並非期望的“寶藏”，而真正的寶物貯藏地點仍是一個謎。在很多情況下，在尋寶開始之前往往無任何信息提示寶藏可能所在的島嶼，此時就必須採取特殊的策略。首先應明確寶藏可能所在的島嶼，然後定位寶藏在島上的具體位置，即定位基因克隆。如果所獲得的信息足以證明寶藏在哪一個島嶼上，根據該島地形、地貌等信息提出若干個可能的藏寶地點，逐一進行排除，最終得到真正的寶藏，即定位候選基因克隆。
值得指出的是，不論套用哪一種策略，一旦找到寶藏，其真實性必須經過多方面反覆地證實。尋寶人需要的是金銀珠寶，而不是磚塊玻璃。同樣，克隆到的致病基因必須證據充分，該基因突變與疾病發生的因果關係必須經過DNA測序分析，患者基因順序的改變或突變不應在正常人中檢測到。實際上，人類致病基因的克隆並無標準化的程式。在具體操作過程中，各種信息的收集、分析、推理，各種技術手段的靈活套用和策略的調整貫穿始終。圖3—3概括說明了疾病基因克隆的一般思路。隨著人類基因組計畫的即將完成，資料庫查詢將變得越來越重要。當然，臨床病例收集和研究，實驗室工作和電腦分析缺一不可，它們之間是相輔相成的。
書摘1
第二節 定位非依賴性基因克隆策略
早期由於實驗室檢查技術的限制，不能對基因片段進行精細作圖，在致病基因克隆時，無任何定位信息可參考。在這種情況下，所有同源順序或基因表達產物的功能信息就顯得非常重要。實際上，第一個疾病基因的克隆就是完全採用定位非依賴性策略而獲得成功的。其主要線索來自蛋白質產物、DNA順序和基因功能方面的信息。
一、蛋白質導向的致病基因克隆
如果遺傳病的生化基礎是已知的，就有可能純化並定性基因表達產物——蛋白質。根據蛋白質的胺基酸順序推測編碼基因順序，由此產生基因特異性寡核苷酸或利用純化的蛋白質產生特異性抗體，用於識別致病基因。’
(一)套用基因特異性寡核苷酸
套用這種方法的前提是分離純化足夠量的蛋白質用於胺基酸測序。根據胺基酸順序找出最低密碼簡併的多肽區域，如甲硫氨酸和色氨酸只能分別由AUG和UGG編碼。由此推測出相應的基因編碼順序，併合成具有各種密碼置換可能的寡核苷酸。以此為探針，掃描cDNA文庫。由於在寡核苷酸混合物中只有一種能與相應的cDNA順序雜交，為提高雜交效率，確保獲得正確的cDNA克隆，應儘量減少不同寡核苷酸的種類。如果獲得特異性cDNA克隆，即可掃描基因組文庫以獲得基因組DNA克隆(圖3—4)，最終獲得突變的致病基因。
編碼凝血因子Ⅷ的血友病A(MIM306700)基因就是以上述技術路線克隆成功的。生化分析表明患者血清標本中，凝血因子Ⅷ存在遺傳性缺乏。由於該因子在血清中含量極低，故用大量豬血清以常規蛋白質純化技術得到少量凝血因子Ⅶ。純化的蛋白質經過測序使基因特異性寡核苷酸探針的合成成為可能(圖3—5)。
(二)套用特異性抗體
如果能夠分離純化少量正常蛋白質，就有可能產生相應的特異性抗體。用特異性抗體識別相關基因的方法，早在1982年就已成功地套用於苯丙酮尿症(MIM261600)致病基因的克隆。苯丙酮尿症是由苯丙氨酸羥化酶(P'AH)缺乏所致。用大鼠肝臟組織純化PAH酶產生的抗體，經免疫沉澱可以獲得含PAH mRNA的多核糖體。純化的mRNA被反轉錄成cDNA並得到特異性大鼠cDNA克隆，以此作為探針篩選人肝臟cDNA文庫，獲得人PAH cDNA克隆。早期方法是採用無細胞體外蛋白質合成體系，現已被抗體篩選cDNA表達文庫的方法取代。源自相關組織的cDNA被克隆到表達載體。插入cDNA的表達質粒在宿主細胞中表達外源性蛋白質多肽，用特異性抗體篩選出表達相應蛋白質的克隆，即可獲得表達該蛋白質的eDNA。
二、DNA順序導向的致病基因克隆
新的人類致病基因有可能通過同源順序，即人類平行進化同源基因或其他物種定向進化同源基因而被識別。DNA順序的信息套用於致病基因克隆已在含有擴增的三核苷酸重複體基因的克隆中獲得了成功。已知擴增的三核苷酸重複體可以引起嚴重的遺傳性神經系統疾病。此類疾病的最大特點是可預見性，即年幼時發病，其後代病情加重。如果臨床資料提示此特點，就有必要對患者進行擴增三連體的篩查。這種方法完全是定位非依賴性的方法。一種新的能引起脊髓小腦性共濟失調(SCA8)的重複體擴增類型已被Koob等於1999年用此類方法發現。
三、基因功能導向的致病基因克隆
基因突變或缺失的細胞，或生物體常表現生物學異常表型，將人DNA隨機片段在具有缺陷的細胞或生物體內表達，其中能夠糾正異常表型的DNA片段可能就是細胞或生物體內突變或缺失的基因。下面就舉數例予以說明。
(一)哺乳動物細胞株
DNA修復機制的缺陷存在於多種哺乳動物細胞株，用紫外線照射或化學誘變劑處理後，這種細胞株常表現異常反應。DNA修復機制缺陷的這些細胞株，或源自患者的細胞可以用正常人DNA或染色體片段轉染，如果某一片段中含有細胞內缺陷的基因，並表達出相應的產物，細胞對紫外線或誘變劑的異常反應就有可能被糾正。范可尼貧血(Fanconianemia，FA)Ⅲ型(FACC；MIM227645)相關基因就是用這種方法克隆的。同樣，腫瘤細胞株的生長調控機制障礙可以通過染色體片段或cDNA克隆的轉染予以糾正，以此定位並克隆腫瘤抑制基因。
(二)酵母細胞
大量突變酵母細胞株的建立為突變基因的克隆創造了極為有利的條件。在生物進化過程中，酵母蛋白質與某些人類蛋白質具有高度的同源性。因此，人類基因或蛋白質突變可以糾正突變酵母細胞株的功能缺陷。人嘌呤和嘧啶生物合成相關的酶蛋白基因和一些重要的轉錄因子就是在突變酵母細胞株中克隆成功的。
(三)轉基因小鼠
小鼠基因偶爾可以通過構建轉基因小鼠系而被克隆。基本原理是用正常細菌人工染色體BAC)克隆(包含可能的候選區域)構建轉基因小鼠系，陽性轉基因鼠與攜有突變基因的小鼠交配，如果子代小鼠突變表型減輕或消失，則BAC轉基因鼠就可能攜帶相應的正常基因。這一策略首先被套用於生物鐘相關基因(clock gem)的克隆，最近Probst等又在複製人NB3耳聾基因的過程中發揮了重要作用(1998年)(圖3—6)。人DFNB3基因定位在相當於小鼠耳聾基因sllaker一2區域。用含有shaker一2候選區域的BAC克隆構建轉基因鼠，通過與Sbaker一2突變小鼠交配，獲得了shakel·一2突變表型被糾正的BAC轉基因鼠，並由此克隆出非典型肌漿球蛋白基因yol5。根據鼠myol5基因順序克隆了人MY015基因，它在DFNB3候選區域的定位已被證實，並在DFNB3受累者中發現了突變位點。
(四)癌基因的克隆
利用細胞轉化實驗克隆激活的癌基因，不失為一種簡單有效的方法。NIH一3T3小鼠成纖維細胞株用癌基因轉染後，可進一步被轉化，表現出惡性細胞的生物學性狀。用人類惡性腫瘤細胞中的隨機DNA片段轉染3T3細胞，在體外培養過程中，部分細胞有可能形成轉化灶，分離被轉化的細胞和基因組DNA，構建噬菌體文庫，用人類特異性Alu重複順序篩選該文庫，就有可能獲得攜有激活癌基因的噬菌體克隆。顯然，這也是一種功能基因克隆的策略。
如果染色體缺失導致人類疾病，識別存在於正常人而不存在於患者的基因，或許是複製人類疾病基因的一條捷徑。一般來說，引起人類疾病的突變基因在患者和正常人組織中的表達水平可能有所不同。當然，錯義突變常導致基因功能改變而非基因表達水平的改變。通過篩選患者與正常人之間基因缺失與否或表達差異，是定位非依賴性基因克隆的又一條途徑。減數克隆的方法適用於由染色體缺失導致的疾病基因的克隆。基本原理就是比較正常DNA和缺失DNA片段的大小或順序，從而識別出導致人類疾病的缺失基因，通常先將正常DNA與過量缺失DNA混合，經過變性和退火以後，形成DNA雙螺旋的兩條鏈，大部分來自正常DNA，其中優先退火的正常DNA順序就反映出患者DNA缺失的順序。這種方法最成功的套用實例就是Duchenne肌營養不良(J9MD)基因的克隆，具體內容將在第三節中敘述。
……
第一節 識別致病基因的原則和策略
人類基因組含有30億個鹼基對，其中編碼順序僅占不足2%。根據2001年2月公布的人類基因組精細圖譜，人類基因數量約為3．5萬個。遠較以往估計的基因數量少。基因結構的變異或突變勢必造成基因表達產物結構、基因表達調控或轉錄本剪下方式的改變，其中部分基因結構和功能的改變最終導致人類疾病表型的發生。由表型追蹤到基因型的過程就是致病基因或疾病易感基因定位、克隆的過程。在過去幾十年當中，這一過程常以年或數十年計。自20世紀80年代以來，由於：PCR技術在連鎖分析和突變掃描中的套用使這一過程大為縮短，尤其是人類基因組信息的積累，基因圖譜、克隆、DNA順序、表達譜和表型資料等的綜合套用，使疾病基因的克隆過程縮短為數星期。在浩瀚的基因組中分離或克隆某一特定基因並對其功能進行系統深入的研究，對完全理解正常或異常表型與其相應基因型之間的關係至關重要。對克隆到的基因進行DNA測序分析有助於闡明基因表達產物在正常生理條件下的功能，突變如何導致該基因產物異常或缺失，不同外顯子發生不同類型的突變對疾病影響的程度等。在此基礎上，一系列實驗技術和方法對闡明基因功能、蛋白質之間的相互作用，突變基因如何干擾細胞內正常生化通路等是必不可少的。根據正常或突變基因順序分析的結果可以建立特異性突變基因的診斷方法；對基因功能的認識又為遺傳病的治療，包括基因治療奠定基礎。
複製人類致病基因的確是一個繁複的系統工程，如果將這一過程形容為“大海撈針”也不為過。以荒島尋寶的過程為例，在未知島嶼上探尋寶藏就如同發現人類致病基因。在有些情況下，寶物貯藏的地點還不止一處。該如何著手尋寶?如果將各方面的信息綜合分析足以明確寶藏所在的島嶼，隨著探導工作的深入，新的信息將會引導尋寶人最終發現真正的寶藏，即功能基因克隆。另一種情況是已知信息使尋寶人對可能藏匿寶物的島嶼提出某種假設，然後集中力量在可能有寶藏的島嶼上搜尋，最終有可能獲得期望的結果，即候選基因克隆。，但意外情況時有發生，在提出充分證據、合理可靠的推測或假設後，仍有可能在錯誤的島嶼上掘地三尺或得到並非期望的“寶藏”，而真正的寶物貯藏地點仍是一個謎。在很多情況下，在尋寶開始之前往往無任何信息提示寶藏可能所在的島嶼，此時就必須採取特殊的策略。首先應明確寶藏可能所在的島嶼，然後定位寶藏在島上的具體位置，即定位基因克隆。如果所獲得的信息足以證明寶藏在哪一個島嶼上，根據該島地形、地貌等信息提出若干個可能的藏寶地點，逐一進行排除，最終得到真正的寶藏，即定位候選基因克隆。
值得指出的是，不論套用哪一種策略，一旦找到寶藏，其真實性必須經過多方面反覆地證實。尋寶人需要的是金銀珠寶，而不是磚塊玻璃。同樣，克隆到的致病基因必須證據充分，該基因突變與疾病發生的因果關係必須經過DNA測序分析，患者基因順序的改變或突變不應在正常人中檢測到。實際上，人類致病基因的克隆並無標準化的程式。在具體操作過程中，各種信息的收集、分析、推理，各種技術手段的靈活套用和策略的調整貫穿始終。圖3—3概括說明了疾病基因克隆的一般思路。隨著人類基因組計畫的即將完成，資料庫查詢將變得越來越重要。當然，臨床病例收集和研究，實驗室工作和電腦分析缺一不可，它們之間是相輔相成的。
書摘1
第二節 定位非依賴性基因克隆策略
早期由於實驗室檢查技術的限制，不能對基因片段進行精細作圖，在致病基因克隆時，無任何定位信息可參考。在這種情況下，所有同源順序或基因表達產物的功能信息就顯得非常重要。實際上，第一個疾病基因的克隆就是完全採用定位非依賴性策略而獲得成功的。其主要線索來自蛋白質產物、DNA順序和基因功能方面的信息。
一、蛋白質導向的致病基因克隆
如果遺傳病的生化基礎是已知的，就有可能純化並定性基因表達產物——蛋白質。根據蛋白質的胺基酸順序推測編碼基因順序，由此產生基因特異性寡核苷酸或利用純化的蛋白質產生特異性抗體，用於識別致病基因。’
(一)套用基因特異性寡核苷酸
套用這種方法的前提是分離純化足夠量的蛋白質用於胺基酸測序。根據胺基酸順序找出最低密碼簡併的多肽區域，如甲硫氨酸和色氨酸只能分別由AUG和UGG編碼。由此推測出相應的基因編碼順序，併合成具有各種密碼置換可能的寡核苷酸。以此為探針，掃描cDNA文庫。由於在寡核苷酸混合物中只有一種能與相應的cDNA順序雜交，為提高雜交效率，確保獲得正確的cDNA克隆，應儘量減少不同寡核苷酸的種類。如果獲得特異性cDNA克隆，即可掃描基因組文庫以獲得基因組DNA克隆(圖3—4)，最終獲得突變的致病基因。
編碼凝血因子Ⅷ的血友病A(MIM306700)基因就是以上述技術路線克隆成功的。生化分析表明患者血清標本中，凝血因子Ⅷ存在遺傳性缺乏。由於該因子在血清中含量極低，故用大量豬血清以常規蛋白質純化技術得到少量凝血因子Ⅶ。純化的蛋白質經過測序使基因特異性寡核苷酸探針的合成成為可能(圖3—5)。
(二)套用特異性抗體
如果能夠分離純化少量正常蛋白質，就有可能產生相應的特異性抗體。用特異性抗體識別相關基因的方法，早在1982年就已成功地套用於苯丙酮尿症(MIM261600)致病基因的克隆。苯丙酮尿症是由苯丙氨酸羥化酶(P'AH)缺乏所致。用大鼠肝臟組織純化PAH酶產生的抗體，經免疫沉澱可以獲得含PAH mRNA的多核糖體。純化的mRNA被反轉錄成cDNA並得到特異性大鼠cDNA克隆，以此作為探針篩選人肝臟cDNA文庫，獲得人PAH cDNA克隆。早期方法是採用無細胞體外蛋白質合成體系，現已被抗體篩選cDNA表達文庫的方法取代。源自相關組織的cDNA被克隆到表達載體。插入cDNA的表達質粒在宿主細胞中表達外源性蛋白質多肽，用特異性抗體篩選出表達相應蛋白質的克隆，即可獲得表達該蛋白質的eDNA。
二、DNA順序導向的致病基因克隆
新的人類致病基因有可能通過同源順序，即人類平行進化同源基因或其他物種定向進化同源基因而被識別。DNA順序的信息套用於致病基因克隆已在含有擴增的三核苷酸重複體基因的克隆中獲得了成功。已知擴增的三核苷酸重複體可以引起嚴重的遺傳性神經系統疾病。此類疾病的最大特點是可預見性，即年幼時發病，其後代病情加重。如果臨床資料提示此特點，就有必要對患者進行擴增三連體的篩查。這種方法完全是定位非依賴性的方法。一種新的能引起脊髓小腦性共濟失調(SCA8)的重複體擴增類型已被Koob等於1999年用此類方法發現。
三、基因功能導向的致病基因克隆
基因突變或缺失的細胞，或生物體常表現生物學異常表型，將人DNA隨機片段在具有缺陷的細胞或生物體內表達，其中能夠糾正異常表型的DNA片段可能就是細胞或生物體內突變或缺失的基因。下面就舉數例予以說明。
(一)哺乳動物細胞株
DNA修復機制的缺陷存在於多種哺乳動物細胞株，用紫外線照射或化學誘變劑處理後，這種細胞株常表現異常反應。DNA修復機制缺陷的這些細胞株，或源自患者的細胞可以用正常人DNA或染色體片段轉染，如果某一片段中含有細胞內缺陷的基因，並表達出相應的產物，細胞對紫外線或誘變劑的異常反應就有可能被糾正。范可尼貧血(Fanconianemia，FA)Ⅲ型(FACC；MIM227645)相關基因就是用這種方法克隆的。同樣，腫瘤細胞株的生長調控機制障礙可以通過染色體片段或cDNA克隆的轉染予以糾正，以此定位並克隆腫瘤抑制基因。
(二)酵母細胞
大量突變酵母細胞株的建立為突變基因的克隆創造了極為有利的條件。在生物進化過程中，酵母蛋白質與某些人類蛋白質具有高度的同源性。因此，人類基因或蛋白質突變可以糾正突變酵母細胞株的功能缺陷。人嘌呤和嘧啶生物合成相關的酶蛋白基因和一些重要的轉錄因子就是在突變酵母細胞株中克隆成功的。
(三)轉基因小鼠
小鼠基因偶爾可以通過構建轉基因小鼠系而被克隆。基本原理是用正常細菌人工染色體BAC)克隆(包含可能的候選區域)構建轉基因小鼠系，陽性轉基因鼠與攜有突變基因的小鼠交配，如果子代小鼠突變表型減輕或消失，則BAC轉基因鼠就可能攜帶相應的正常基因。這一策略首先被套用於生物鐘相關基因(clock gem)的克隆，最近Probst等又在複製人NB3耳聾基因的過程中發揮了重要作用(1998年)(圖3—6)。人DFNB3基因定位在相當於小鼠耳聾基因sllaker一2區域。用含有shaker一2候選區域的BAC克隆構建轉基因鼠，通過與Sbaker一2突變小鼠交配，獲得了shakel·一2突變表型被糾正的BAC轉基因鼠，並由此克隆出非典型肌漿球蛋白基因yol5。根據鼠myol5基因順序克隆了人MY015基因，它在DFNB3候選區域的定位已被證實，並在DFNB3受累者中發現了突變位點。
(四)癌基因的克隆
利用細胞轉化實驗克隆激活的癌基因，不失為一種簡單有效的方法。NIH一3T3小鼠成纖維細胞株用癌基因轉染後，可進一步被轉化，表現出惡性細胞的生物學性狀。用人類惡性腫瘤細胞中的隨機DNA片段轉染3T3細胞，在體外培養過程中，部分細胞有可能形成轉化灶，分離被轉化的細胞和基因組DNA，構建噬菌體文庫，用人類特異性Alu重複順序篩選該文庫，就有可能獲得攜有激活癌基因的噬菌體克隆。顯然，這也是一種功能基因克隆的策略。
如果染色體缺失導致人類疾病，識別存在於正常人而不存在於患者的基因，或許是複製人類疾病基因的一條捷徑。一般來說，引起人類疾病的突變基因在患者和正常人組織中的表達水平可能有所不同。當然，錯義突變常導致基因功能改變而非基因表達水平的改變。通過篩選患者與正常人之間基因缺失與否或表達差異，是定位非依賴性基因克隆的又一條途徑。減數克隆的方法適用於由染色體缺失導致的疾病基因的克隆。基本原理就是比較正常DNA和缺失DNA片段的大小或順序，從而識別出導致人類疾病的缺失基因，通常先將正常DNA與過量缺失DNA混合，經過變性和退火以後，形成DNA雙螺旋的兩條鏈，大部分來自正常DNA，其中優先退火的正常DNA順序就反映出患者DNA缺失的順序。這種方法最成功的套用實例就是Duchenne肌營養不良(J9MD)基因的克隆，具體內容將在第三節中敘述。
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