適於神經環路標記的重組腺相關病毒新型高效製備系統

適於神經環路標記的重組腺相關病毒新型高效製備系統

《適於神經環路標記的重組腺相關病毒新型高效製備系統》是依託中國科學院精密測量科學與技術創新研究院,由吳陽擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

  • 中文名:適於神經環路標記的重組腺相關病毒新型高效製備系統
  • 項目類別:青年科學基金項目
  • 項目負責人:吳陽
  • 依託單位:中國科學院精密測量科學與技術創新研究院
項目摘要,結題摘要,

項目摘要

神經環路的結構和功能是目前各類腦工程的核心內容,所需的新技術新方法作為這些巨額工程成功實施的基礎而備受關注。重組腺相關病毒(rAAV)已被廣泛用於外源基因轉導神經細胞,神經環路的標記、監控和操縱,在基礎和臨床腦科學研究、神經疾病基因治療等領域發揮著重要作用。但rAAV的大規模製備一直都是限制其套用的瓶頸問題。雖然近年來利用昆蟲桿狀病毒(Bac)表達系統製備rAAV的方法獲得了明顯進展,但仍存在靈活性差、通用性低、產量不高、病毒質量不穩定等缺點。本研究擬基於分子遺傳學和病毒學基本原理,利用光誘導表達技術和核糖體泄露掃描機制,整合rAAV複製的調控元件和包裝所需的組件,建立靈活、通用的大規模製備rAAV的新型One Bac系統,並整合入各類神經環路結構揭示與功能研究體系中,驗證其套用效能。項目的成功實施將為神經科學,尤其是對大型靈長類動物的研究,以及神經疾病基因治療等領域提供高質量的載體工具。

結題摘要

病毒工具在神經環路的結構和功能解析中有著至關重要的作用。重組腺相關病毒(rAAV)在基礎和臨床腦科學研究、神經疾病基因治療等領域套用廣泛。但rAAV的大規模製備一直都是限制其套用的瓶頸問題。當前基於桿狀病毒表達系統的大規模rAAV生產系統仍然方法複雜,成本高,而且缺乏通用性和靈活性。為此,本研究建立了不依賴Sf9包裝細胞系的One Bac系統,首先構建了一種能夠生產rAAV的新穎的整合了所有rAAV包裝元件的重組桿狀病毒(BEV)。新系統的BEV感染Sf9細胞所獲得的rAAVs產量超過10E+5VG/cell。BEV有很高的穩定性,在至少四次連續傳代之後病毒的穩定性沒有明顯的下降。 新系統製備的rAAV具有很高的病毒質量和轉導活性。另外,BEV感染的甜菜夜蛾的幼蟲也產生出了rAAV,每個幼蟲的產量可以達到 2.75×10E+10 VG。昆蟲幼蟲產生的rAAV2在結構上與HEK293細胞產生的 rAAV2類似,顯示出很高的轉導活性。利用昆蟲幼蟲低成本生產rAAV的新方法具有很大的套用潛力。本研究還建立了依賴Sf9包裝細胞系的OneBac系統,包括一個攜帶組成性表達GFP報告基因和能夠在BEV感染後誘導表達AAV Rep基因的通用性高的Sf9/Rep包裝細胞系,以及一個同時攜帶AAV Cap基因和rAAV ITR-GOI基因組的重組桿狀病毒BEV/Cap-(ITR-GOI)。通過簡單的BEV重建就可以實現不同的Cap基因血清型rAAV的靈活製備。該系統rAAVs的產率達到10E+5 VG/cell,接近國際同類系統的水平。本研究成功建立了大規模高效製備適用於大腦神經細胞標記的rAAV的新技術平台,製備出的rAAV適用於非人靈長類,在獼猴大腦實驗中取得了很好的標記效果。總之,本研究的成果有效解決了rAAV大規模高效製備的難題,將有力促進rAAV在神經科學研究以及神經疾病基因治療等領域的套用發展。

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