《裂殖酵母線粒體轉錄因子Mtf1 RNA甲基轉移酶活性的探索》是依託復旦大學，由蔣恆義擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：裂殖酵母線粒體轉錄因子Mtf1 RNA甲基轉移酶活性的探索
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：蔣恆義
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
線粒體具有獨立的基因組，其轉錄由線粒體RNA聚合酶及其轉錄因子完成。酵母的線粒體轉錄因子Mtf1在蛋白序列和結構上具有RNA甲基轉移酶的特徵，然而目前還缺乏相關的生化證據證明該活性。本項目擬通過TAP親和免疫共沉澱法獲取與Mtf1結合的RNA，然後將RNA逆轉錄並克隆建庫並測序，來獲取與Mtf1直接結合的RNA序列信息，以此信息為基礎進行體內RNA的甲基化檢測，以及體外Mtf1甲基轉移酶活性的測定來確認Mtf1是否具有甲基轉移酶活性；構建Mtf1缺失甲基轉移酶活性的突變菌株，通過觀察該菌株的形態、生理、生化指標來推測Mtf1的甲基轉移酶功能的生物學功能。該項目的完成將為線粒體轉錄調控機制的研究提供新的視角，並為線粒體相關的多種疾病研究開闢新思路。
結題摘要
線粒體具有獨立的基因組，其轉錄由線粒體RNA聚合酶及其轉錄因子完成。酵母的線粒體轉錄因子Mtf1在蛋白序列和結構上具有RNA甲基轉移酶的特徵，然而還缺乏相關的生化證據證明該活性。本項目通過一些初步的實驗，初步證明了裂殖酵母Mtf1具有RNA甲基轉移酶活性。在項目中建立了多個方面研究RNA甲基轉移酶的方法包括質譜法檢測體內RNA甲基化狀態的方法、鄰近閃爍檢測RNA甲基轉移酶活性的方法、高效液相法在體外觀察酶促RNA甲基化的方法。我們構建了相關的大腸桿菌的KSGA突變菌株, 在完成了該菌株的Kasugamycin耐藥性的測試後, 在該菌株中轉入Mtf1過表達質粒, 發現其恢復了 Kasugamycin的敏感性, 提示Mtf1可以彌補KsgA敲除造成的缺陷, 進一步提示, Mtf1可能可以甲基化KsgA的目標序列，從而在體內觀察到了Mtf1的替代KsgA甲基轉移酶活性。然而，通過質譜法檢測體內RNA甲基化狀態,我們暫未觀察到Mtf1導致的KsgA目標RNA的甲基化，可能是Mtf1雖然與KsgA有相似的功能，但是其作用底物序列有一定保守性但是不完全相同，造成其對KsgA目標序列活性下降。該項目的完成將為線粒體轉錄調控機制的研究提供新的視角，為真菌耐藥機制的研究提供新的線索，並為線粒體相關的多種疾病研究開闢新思路
