表征天然豐度酵母細胞色素c多構象的液體14N NMR方法研究

《表征天然豐度酵母細胞色素c多構象的液體14N NMR方法研究》是依託中國科學院精密測量科學與技術創新研究院，由孫鵬擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：表征天然豐度酵母細胞色素c多構象的液體14N NMR方法研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：孫鵬
• 依託單位：中國科學院精密測量科學與技術創新研究院

項目摘要

蛋白質功能相關的多構象現象正成為新的研究熱點。核磁共振波譜（NMR）是一種非常有效的獲得生物大分子原子水平結構及動力學信息的技術.然而，對於同時存在多種構象的蛋白，由於很難獲得與某一特定功能相關的單一構象，通常需要外源標記技術以區分不同的構象，這些方法往往操作複雜、費用昂貴、而且可能影響目標蛋白的固有性質。因此，發展新的內源探針來表征多構象蛋白具有非常重要的意義。細胞色素c是一種非常典型的存在多種構象且行使多種生物學功能的蛋白質，同時在呼吸作用和細胞凋亡中起重要作用，研究細胞色素c的多構象現象對於人們理解細胞色素c如何發揮其功能有重要的幫助。本項目中，申請人將發展基於液體14N NMR的蛋白質動力學表征方法，並以此為探針研究天然豐度釀酒酵母iso-1細胞色素c功能相關的構象轉變。項目的順利實施會幫助人們理解細胞色素c結構與功能的關係，也將為天然提取蛋白質的動力學研究提供新的技術方法和路線。

結題摘要

細胞色素c是一種重要的多功能多構象蛋白質，在生物體的呼吸作用和細胞凋亡中發揮重要作用。根據外界條件的不同，為了行使不同的功能，細胞色素c表現出多種不同的構象。對細胞色素c多構象的表征是理解其功能機制的關鍵。NMR是研究蛋白質構象轉變和互作動力學的有效方法，但是幾乎所有蛋白質NMR方法均依賴於大腸桿菌重組表達的同位素標記甚至選擇性同位素標記樣品，這對於轉錄後修飾蛋白或難以通過大腸桿菌表達的蛋白是一種致命的限制。在本項目中，我們根據14N NMR線寬隨原子核周圍電場對稱性增加而減小的基本原理，發展了適合生物大分子的1H-14N 異核單量子相關技術，以細胞色素c三甲基修飾的72位賴氨酸為探針，在天然豐度下成功實現了無標記細胞色素c的多種構象同時檢測。我們發現，細胞色素c在鹼性條件下會轉變成兩種鹼性構象，同時伴隨生成一種Heme基團暴露的過氧化酶活性構象，證實其為細胞色素c在鹼性條件下表現出高過氧化酶活性的原因。由於該技術具有極佳的信號選擇性，我們將該技術推廣到活細胞體系，實現了釀酒酵母生長過程中的細胞膜中的膽鹼類衍生物含量變化的線上檢測。綜上，本項目發展了適合生物大分子的1H-14N異核單量子相關技術，該技術具有極高的信號選擇性，是極少數可以在天然豐度無標記條件下實現複雜生物系統研究的NMR方法，在蛋白質甲基化修飾研究中具有較好的套用前景。