血漿蛋白結合率

血漿蛋白結合率（binding rate of plasma protein， BRPP）系指藥物吸收入血液後，多數與血漿蛋白結合，治療劑量的藥物與血漿蛋白結合的百分率。

在正常情況下，各種藥物以一定的比率與血漿蛋白結合，在血漿中常同時存在結合型與游離型。而只有游離型藥物才具有藥物活性。當兩種藥物聯合套用時蛋白結合能力較強的藥物分子占領結合部位，使其他藥物不能得到充分的結合，以致後者的游離部分增多，藥效增強。這種相互作用對一些蛋白結合率較高的藥物具有意義，因此要注意那些藥效較強烈或毒性較大的藥物，以防止藥物自結合部位置換下來，使藥效增強，常具有一定的危險性。

基本介紹

• 中文名：血漿蛋白結合率
• 藥物形式：藥物進入循環後，有兩種形式：
• 現象：結合物無活性、有競爭置換現象
• 不能：不能跨膜轉運、代謝和排泄

特點

血漿蛋白結合率為可逆性疏鬆結合，結合型藥物分子量增大，不能跨膜轉運、代謝和排泄，並暫時失去藥理活性，某些藥物可在血漿蛋白結合部位上發生競爭排擠現象。藥物分子與血漿蛋白結合的特點（和藥物與受體蛋白結合情況相似）：具有飽和性與可逆性、結合物無活性、有競爭置換現象。

測定方法

平衡透析法

平衡透析法是定量研究蛋白質與小分子結合平衡的一種傳統且成熟的膜分離技術。平衡透析法的工作原理是基於分子大小或者重量不同，將大分子溶液和小分子溶液分別置於只允許小分子透過而不允許大分子透過的半透膜兩側，它是在無外力驅動條件下，藥物分子擴散透過半透膜，當透析達到平衡時，測定膜兩側溶液中小分子的濃度，通過計算即可分析得大分子與小分子結合的數據。該方法在溶液中完成，血漿和緩衝液的pH值以及離子強度保持相對恆定，可以最大限度反映體內情況，結果可靠，故經常作為經典參比方法。龍友琦等採用平衡透析法測定了不同濃度下丙泊酚微乳注射液的血漿蛋白結合率。結果證明丙泊酚微乳注射液屬於高蛋白結合藥物，套用時應充分考察藥物聯用時其對蛋白結合率的影響，保證人體用藥的安全。

平衡透析法存在耗時過長的缺點，通常需要12-48h。半透膜與蛋白質易產生體積遷移效應，對於帶電的蛋白質可能產生Gibbs-Donna效應以及非特異性的透析設備表面的藥物吸附效應。目前商品化96孔平衡透析裝置套用於血漿蛋白結合率的測定，該裝置能夠減少非特異性的透析設備表面的藥物吸附，並且能夠加速待測樣品的溶解，縮短平衡時間，提高樣品分析的通量。此外，平衡透析法結合電化學發光，螢光以及質譜等高靈敏度檢測方法已經套用於血漿蛋白結合率的測定。周玲玲等採用傳統的平衡透析方法，利用毛細管電泳-電化學發光技術成功的測定了丙吡胺與人血漿蛋白的結合率。

微透析法

微透析技術是一種活體細胞外液的生化物質採樣分析技術。因其獨有的微創性和取樣的連續性，現已被廣泛套用於腦組織各種病理生理現象的探索性實驗、神經生物化學的檢測和藥物代謝研究。微透析法用於藥物血漿蛋白結合率測定，基於藥物與大分子蛋白結合後不能穿透具有一定相對分子質量截留值的微透析的半透膜，而游離藥物可通過半透膜，從而間接測定藥物的血漿蛋白結合率。因其採集的多為不能透過透析膜的小分子物質，即游離藥物，故可以進行實時的蛋白結合率研究[。微透析取樣造成的藥物損失可以忽略不計，使測定結果更為準確；極少的藥物採樣量和採樣體積保證採樣過程中濃度始終恆定是其相較其他蛋白結合率測定方法的優越性所在。張英豐等利用微透析技術進行採樣，運用HPLC-UV檢測，採用零淨通量法測定了高、中、低濃度下鹽酸青藤鹼的大鼠離體血漿蛋白結合率。但是，此法只可測定藥物的游離濃度，而得不到總濃度或結合藥物濃度的信息。

近年來，微透析與高效液相色譜、毛細管電泳或質譜等分析儀器聯用在生命過程動態變化的研究中顯示出很好的發展前景。董文彬等採用微透析結合高效液相色譜技術，測定米諾環素與大鼠血漿蛋白結合率，獲得了米諾環素在大鼠血液和腦內的藥動學參數。

超濾法

超濾法與平衡透析法相似，也是研究蛋白質與小分子結合作用的常用方法。該方法是在壓力差的驅動下，藥物分子擴散透過半透膜。超濾法的最大優點是實現血漿中游離小分子的快速分離、用時短，與平衡透析法相比，大大提高了分離速率。但該方法也同樣存在Gibbs-Donna效應、非特異性的透析設備表面的藥物吸附效應以及蛋白質泄漏等缺點。由於該方法操作簡單、分析快速以及商品化96孔平衡透析裝置的套用，超濾法可用於藥物篩選，療效追蹤以及臨床藥理與藥效學研究中大規模生物樣品的游離藥物濃度分析和藥物蛋白結合率的測定。

此外，陳瑩等採用超濾法結合高效液相色譜法(HPLC)對冬凌草甲素與大鼠、家兔和健康人血漿的蛋白結合率進行測定。結果表明此法簡便快速、靈敏度高、專屬性好，能夠滿足測試生物樣品的要求。

超速離心法

超速離心法的基本原理是在一定的離心力場的作用下，根據小分子與蛋白質在液體介質中沉降速度或密度不同而停留在液體介質中不同的位置而分離的方法。在藥物蛋白結合率的測定中，蛋白結合的藥物形成沉澱，游離的藥物小分子在離心管的上清液中被定量測定。此法的優點是克服了Gibbs-Donna效應以及膜吸附效應等與透析膜有關的缺點。李秋紅等採用超速離心法除掉血漿蛋白，並用高效液相色譜法對高、中、低劑量給藥後的丁香苦苷血藥質量濃度進行測定。結果證明丁香苦苷血漿蛋白結合率不具有質量濃度依賴性，丁香苦苷臨床用藥有較好的安全性。

與平衡透析法相比，該方法使用的儀器較貴，沉降、反向擴散及黏度等物理現象影響游離藥物濃度準確定量，因而限制了該方法的套用。

以光譜學為基礎的方法

光譜技術也多用於藥物血漿蛋白結合常數測定。藥物與蛋白質結合生成超分子複合物後，體系的光譜、電化學性質發生改變，從而提供蛋白質濃度或結構方面的信息。常用的光譜法包括紫外-可見吸收光譜法(UV-visible)，螢光光譜法(fluorescence)，紅外光譜法(infrared)，元二色譜法(circulardichroism，CD)，旋光法(opticalrotatorydispersion，ORD)以及核磁共振法(NMR)。利用這些方法除了可以測定藥物與蛋白質結合率，還可以獲得蛋白質和藥物的結合位點數、結合位置、作用力類型以及在藥物作用下蛋白質結構與功能變化的信息。光譜學技術不適合研究多平衡體系。

螢光光譜法具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少等優點，因此在研究小分子與蛋白質的相互作用中，螢光光譜法占有重要地位。但該法需要經過大量的計算，較其他方法不簡便、不直觀。

表面電漿子共振技術是近年來研究很熱門的一種新技術，它採用的也是基於光譜技術的一種方法。它的基本原理是當一定特定角度的入射光進入感應片的玻璃稜鏡內時，產生的全內反射消失波，與表面電漿將發生共振，入射光被吸收，導致反射光能量急劇下降，因此反射光譜上出現共振峰(即反射強度最低值)。表面介質折射率的任何微小改變都將使入射角度發生遷移，這種變化被探測器捕獲，並轉化為相應譜圖。利用表面電漿共振技術研究藥物與蛋白的作用情況，具有不需標記及檢測快速等優點。但該法所用的儀器都較複雜，價格也較昂貴，難於小型化。迄今，這一技術已在抗體-抗原反應研究、模擬細胞膜與藥物作用機理研究、DNA與蛋白質相互作用分析及病毒測定研究等方面取得不少成果，在食品、藥物、生物技術及生物製藥等領域也越來越受到重視。

高效親和色譜法

高效親和色譜法用於測定藥物與血漿蛋白的結合，可由藥物的遷移變化率的連續變化計算出藥物與蛋白的結合常數。色譜系統良好的精密度和重現性可提供大量結合作用的對比研究，並易於與MS等技術聯用。該方法允許多種藥物同時進樣，並可同時測定多種藥物與蛋白的結合常數，對立體選擇性蛋白結合的研究非常有用。

高效親和液相色譜法是研究小配體與生物大分子之間相互作用的有力工具，其固定相是固定化的生物高聚物(酶、受體、離子通道或抗體)。親和毛細管區帶電泳在研究藥物蛋白結合作用方面具有分離效率高、擴散係數小、樣品用量少、儀器操作簡單，可以採用與活體生理條件相同(或相似)的體系進行研究等優點。

微量熱法

微量熱法是近年來發展起來的一種研究生物熱化學與生化過程動力學的重要方法，該法對反應體系的溶劑性質、光譜性質和電學性質等沒有任何限制條件，在測定中也不需添加任何試劑，不會干擾生物體系的正常活動與代謝，已被先後用於一些抗腫瘤藥物、生物染料、藥物小分子與DNA或蛋白質的相互作用。

研究趨勢

近年來，隨著藥動學的深入研究，藥物與血漿蛋白的結合率已成為藥學領域中的研究熱點，特別是對於那些血漿蛋白結合率高的藥物。平衡透析法雖然操作複雜且費時，但是分析成本低，可以直接得到游離小分子的濃度，仍然為常規的測定方法。光譜法可以測定藥物與蛋白質結合率，此外還可以獲得蛋白質和藥物的結合位點數，結合位置，作用力類型以及在藥物作用下蛋白質結構與功能變化的信息，但光譜學技術不適合研究多平衡體系。色譜法是近年來研究藥物與血漿蛋白結合率發展最快的方法，特別是毛細管電泳法具有操作簡單、分離效率高、樣品用量少以及研究可以在近生理環境中進行等優點，已經成為研究藥物蛋白結合作用的有效方法，正在被廣泛地研究與套用。但是毛細管電泳法常規的紫外檢測器的靈敏度較差，限制了低藥物濃度與蛋白結合作用的套用研究，因此發展高靈敏度檢測器仍然是毛細管電泳領域研究的熱點。