基本介紹
- 中文名：螢光免疫層析技術
- 外文名：Fluorescence immunochromatography Assay
- 簡稱：FICA
- 屬於：免疫層析技術(ICA)
- 原理：抗原抗體特異性免疫反應
- 特點：螢光標記抗體或抗原
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免疫層析技術
免疫層析技術(ImmunochromatographicAssay，ICA)是20世紀末發展起來的結合免疫技術和色譜層析技術的一種分析方法，該方法具有特異性、操作簡單、快速等特點，廣泛套用於臨床診斷、環境監測、食品安全等重要領域。傳統免疫層析技術以膠體金為標記物，通過條帶顯色對目標物定性檢測或半定量分析。該方法雖然簡單快速，但靈敏度較差，難以準確定量。螢光免疫層析技術作為一項新型免疫檢測技術，既保留了傳統膠體金試紙條的現場快速檢測優點，又加入了勞光儉測技術的高靈敏度特點，成為提高免疫層析方法檢測性能的主要途徑之一。
螢光免疫層析技術
螢光免疫層析技術是基於抗原抗體特異性免疫反應的新型膜檢測技術。該技術以固定有檢測線(包被抗體或包被抗原)和質控線(抗抗體)的條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，螢光標記抗體或抗原固定於連線墊，通過毛細管作用使待分析物在層析條上移動。對於帶有多個抗原決定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常採用“三明治”型雙抗夾心免疫層析方法，即待測物在流動相作用下先與螢光標記抗體結合，當到達檢測線時再與包被抗體結合形成雙抗夾心的“三明治”型。對於只具有單一抗原表位的小分子抗原(農獸藥、違禁藥物等)，待測小分子抗原與螢光標記抗體結合後，由於空間位阻作用難以再與檢測線上的包被抗體結合。所以，具有單一抗原表位的小分子待測物多採用競爭免疫層析法檢測。
螢光標記物種類及螢光免疫層析技術套用
螢光免疫層析分析方法具有靈敏度高、穩定性好、受自然螢光干擾低等優點，成為食品質量安全快速檢測分析研究的熱點。目前，用於螢光免疫分析的標記物主要包括螢光素、量子點、上轉換納米粒子等。
螢光素免疫螢光層析技術
螢光素是指具有螢光特性的有機染料。1942年Coons等首次報導了異氰酸螢光素標記抗體用於檢測鼠組織切片中肺炎球菌抗原分布的研究，由此出了免疫螢光技術。後來，為了改進異氰酸螢光素的性能，Ruggas等合成了性質穩走、毒性較低的異硫氰酸螢光素。自Marshall等改良了螢光抗體標記技術後，螢光免疫技術得到快速發展。目前，套用於螢光免疫分析的螢光素主要有5種：異硫氰酸螢光素、四乙烯基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、與酶作用後產生螢光的物質和鑭系。
宋春美等採用異硫氰酸灸光素作為標記材料標記萊克多巴胺單克隆抗體，套用免疫層析技術研製萊克名巴胺螢光檢測試紙條並對其靈敏度、特異性、重複性進行了測定。研究結果表明，該免疫層析試紙條的檢測限為1μg/L，較同一抗體的膠體金試紙條的敏感性提高了10倍；與結構類似物物交叉反應結果顯示：該方法具有良好的特異性；以不同批次的檢測試紙對牛奶等樣品中萊克多巴膠殘留進行檢測，結果一致性較高，重現性良好。
螢光材料在免疫層析技術中的套用顯著提高了該方法的檢測性能。然而，有機染料標記物光照下易分解，易發生光漂白現象，具有濃度猝滅特徵，影響了分析結果的準確性和可靠性。將螢光素包裹於聚苯乙烯微球是提高螢光素分析性能的有效方法。
量子點免疫層析技術
量子點(QuantumDots，QDs)是一種半導體螢光納米顆粒，直徑通常在1-20nm之間，一般由II-VI或III-V族元素組成。與有機染料螢光標記材料相比，量子點具有斯托克斯位移大，激發光譜寬、發射光譜窄，螢光發射強度強而穩定，量子產率高，耐光漂白，成為分析檢測領域研究的新熱點。
白亞龍以紅色CdTe量子點為代表，通過免疫層析法探討了量子點與小鼠1gG抗體的最佳偶聯方式，結果顯示以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(CEDC)與N-羥基琥珀醯亞胺（NHS)的混合物(質量比3：4)為偶聯劑製備的螢光探針性能優於直接偶聯和以DEC和NHS單獨作為偶聯劑偶聯的到的螢光探針；採用矽烷偶聯試劑APTES氨基化的二氧化矽納米粒子(50-500nm)為載體，通過偶聯試劑EDC與NHS將其與CdTe量子點偶聯，製備得到了高強度的螢光微球；初步研究結果表明螢光免疫層析方法的靈敏度比膠體金免疫層析體系高4-20倍。
上轉換納米粒子免疫層析技術
上轉換髮光是指反-斯托克斯發光，即用低能量的紅外或近紅外光激發發射出高能量的紫外或可見光。上轉換髮光大都發生在摻雜稀土離子的化合物中，NaYF2是目前上轉換髮光效率最高的基質材料。與螢光染料、量子點相比，上轉換納米粒子毒性低，靈敏度高，穩定性好，可避免由於樣品中具有螢光特性基質對檢測結果的影響，是目前理想的螢光標記物之一。
王浩然等基於上轉換免疫螢光單靶標檢測試紙，成功研製出對乙型副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌O1和0139群、大腸桿菌O157，甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等10種食源性致病菌具有現場檢測能力的十通道試紙盤檢測系統，可滿足食品樣品增菌檢測和腹瀉樣本直接檢測的靈敏度要求。劉曉等,以上轉換髮光材料為標記物，建立了可對奶製品中黃麴黴毒素M1進行現場快速檢測的上轉換螢光免疫層析快速定量檢測方法。最優條件下，該方法對奶粉和牛奶中黃麴黴毒素M1的檢測靈敏度分別達到0.1ng/mL和0.3ng/mL，每個濃度重複測量的變異係數小於15%。該研究構建的上轉換螢光免疫層析試紙條檢測方法操作簡便快捷、樣品前處理簡單、具有良好的檢測敏感性和特異性，對實際樣品的耐受性較好，可滿足食品安全中對現場快速檢測的需求。
Liu等以核殼型NaGdF4：Yb納米顆粒與頭孢氨芐抗體偶聯作為螢光探針，噴塗於結合墊，以頭孢氨芐-牛血清白蛋白偶聯物和羊抗鼠抗抗體分別噴塗於硝酸纖維素膜上作為檢測線和質控線。最優條件下，建立的上轉換螢光免疫層析方法的目測檢測線為10ng/mL，定量檢測的線性範圍為0.5-100ng/mL。
