蛋白質與蛋白質組學實驗指南（翻譯版）

內容簡介

*蛋白質結構的背景知識
*蛋白質樣品製備和分析的各種實驗方法，從傳統的化學分析，到經典的色譜、
質譜技術，直至最新的蛋白質晶片和信息學方法
*上述各種技術方法的原理、套用，以及相關的支持性信息和參考資料
針對蛋白質不同的研究目的(如樣品製備、結構測序或功能研究)，每一章儘可能完全地羅列了各種實驗方案，可供不同規模實驗室的研究者選擇套用。在介紹每一個實驗方案時，以“step—by—step”操作指南的形式逐步展開，詳細列出實驗儀器、試劑及操作步驟，並針對常見問題給出經驗性的提示或解決方案。毫無疑問，對於蛋白質化學、生物化學的研究人員在蛋白質組學這一新興領域尋求最新的技術方法，本書是一部必備的實驗指南。而對於遺傳學、細胞生物學、分子生物研究人員開展表型和細胞功能研究，以及醫學和生物工程領域開展蛋白質相關研究，本書也是基本的實驗工具書。

第1章蛋白質組學導論1
1.1蛋白質組學定義3
1.2為何除基因組學外還要有蛋白質組學？5
1.3蛋白質的鑑定和分析10
1.4差異顯示蛋白質組學（比較蛋白質組學）17
1.5翻譯後修飾19
1.6蛋白質微陣列23
1.7捕獲分子和靶分子24
參考文獻26
網路資源33第2章單向聚丙烯醯胺凝膠電泳35
2.1聚丙烯醯胺凝膠電泳的基本原理38
2.2SDS用於變性的聚丙烯醯胺凝膠42
2.3乙酸尿素PAGE根據蛋白質的大小和電荷分離蛋白質45
2.4三羥甲基甘氨酸SDSPAGE分離小分子多肽45
2.5非變性PAGE（自然凝膠電泳）分離天然蛋白和蛋白複合體45
實驗方案
方案1蛋白質的SDSPAGE47
替代方案：用BioRad385GradientFormer灌制線性梯度凝膠52
方案2～7的導言：蛋白質顯色步驟56
方案2傳統的考馬斯亮藍染色58
方案3快速考馬斯亮藍染色60
方案4InstaStainBlue凝膠紙染色62
方案5SYPRORuby螢光染色64
方案6SYPROOrange螢光染色66
方案7與質譜兼容的銀染68
方案8表觀分子量的判定70
方案9CTABPAGE72
方案10酸尿素連續PAGE74
方案11肽類的電泳（TricineSDSPAGE）76
方案12蛋白質的非變性PAGE78
參考文獻80
網路資源82第3章細胞和亞細胞提取物的製備83
3.1通過機械或化學方法破碎組織及細胞85
3.2通過變性和復性從包含體中回收重組蛋白88
3.3富含目的蛋白的亞細胞提取物的製備90
實驗方案
方案1哺乳動物組織的勻漿93
附加方案：從組織勻漿液中去除黏蛋白97
方案2用於免疫沉澱的培養細胞的裂解98
方案3用於免疫印跡的動物培養細胞、酵母和細菌的裂解100
方案4氮艙減壓法裂解培養細胞102
方案5細菌中重組蛋白的小量提取106
方案6細菌中重組蛋白的大量提取108
方案7從包含體中溶解大腸桿菌重組蛋白110
方案8酵母提取物的製備112
方案9真核細胞結構組分的差異去垢劑分離法114
附加方案：去垢劑提取物中RNA的分離123
附加方案：用鎂沉澱微管蛋白和微管結合蛋白124
參考文獻126
選讀文獻130
網路資源130第4章固相化pH梯度雙向凝膠電泳131
4.1雙向凝膠電泳樣品的製備134
4.2第一向:固相pH梯度等電聚焦電泳138
4.3第二向:根據分子量分離蛋白質139
4.4雙向凝膠的染色141
4.5雙向凝膠中蛋白質的轉移144
4.6雙向凝膠圖像的獲取和分析145
實驗方案
方案1雙向凝膠電泳鼠肝蛋白質提取物的製備149
方案2雙向凝膠電泳真核生物細胞裂解物的製備151
附加方案：用放射性同位素標記真核生物細胞蛋白質152
方案3雙向凝膠電泳大腸桿菌裂解液的製備154
方案4雙向凝膠電泳腦脊液蛋白樣品的製備156
方案5第一向：蛋白質的等電聚焦電泳158
方案6垂直SDS平板凝膠的製備：均一凝膠的灌制162
方案7垂直SDS平板凝膠製備：同時灌制多梯度凝膠165
方案8IPG膠條的平衡169
方案9第二向：蛋白質的SDSPAGE171
方案10膠體考馬斯亮藍染色174
方案11銀氨染色176
方案12與質譜兼容的銀染法180
方案13用SYPRORuby進行螢光染色183
方案14用GelCode磷蛋白染色試劑盒對磷蛋白進行染色185
方案15雙向凝膠的槽式轉移187
方案16雙向凝膠的半乾印跡190
方案17～20的導言：膜上蛋白質的染色192
方案17用麗春紅S染色膜上的蛋白質193
方案18用考馬斯亮藍R250染色膜上的蛋白質194
方案19用印度墨水染色膜上的蛋白質195
方案20用膠體金染色膜上的蛋白質196
網路上有關雙向電泳的信息資源197
參考文獻200第5章反相高效液相色譜203
5.1RPHPLC基於疏水相互作用分離分子204
5.2RPHPLC標準色譜條件205
5.3微柱反相色譜——適合蛋白質組學的研究方法213
實驗方案
方案1蛋白質RPHPLC的標準色譜條件219
方案2填充RPHPLC毛細管微柱224
方案3不易分離的大分子量多肽的純化231
方案4用RPHPLC對固相合成的多肽進行純化238
方案5用RPHPLC技術對多肽和蛋白質混合物進行脫鹽244
方案6計算機輔助方法最佳化梯度條件的RPHPLC蛋白質分離248
參考文獻258
選讀文獻263
網路資源263第6章蛋白質氨基端及羧基端序列分析265
6.1Edman降解法對多肽進行氨基端測序267
6.2限制序列分析速度的幾個環節275
6.3套用HPLC和PAGE製備微量測序樣品279
6.4不能進行測序的蛋白質需去封閉282
6.5磷酸化位點的微量測序分析有助於繪製信號途徑283
6.6固相測序儀是回收磷酸化胺基酸的最好方法283
6.7其他氨基端反應法284
6.8羧基端測序方法存在的問題284
6.9自動化羧基端測序285
6.10高靈敏度高效率的羧基端分析285
6.11氨基端和羧基端序列組合分析289
實驗方案
方案1兩相柱測序儀的樣品上樣291
方案2將蛋白質從凝膠電轉移至PVDF膜293
方案3檢測PVDF膜上的蛋白質297
方案4濃縮聚丙烯醯胺凝膠上的蛋白質點299
方案5磷酸化多肽的固相微量測序302
方案6羧基端序列分析304
單位換算指南307
參考文獻309
選讀文獻312
網路資源313第7章電泳分離的蛋白質肽譜和序列分析315
7.1製備肽譜的微量方法和大規模方法318
7.2消除蛋白質分子內部的共價交聯以提高肽譜質量319
7.3酶法和化學法裂解多肽鏈323
7.4基於SDSPAGE的肽譜製備方法（Cleveland法）333
7.5肽譜用於確定蛋白質中的二硫鍵334
7.6套用RPHPLC製備肽譜335
實驗方案
方案1蛋白質的過甲酸氧化339
方案2蛋白質還原和S羧甲基化：大規模方法341
方案3蛋白質還原和S羧甲基化：微量方法344
方案4用Ellman試劑測定自由巰基和二硫鍵347
方案5蛋白質的胰酶消化349
附加方案：用琥珀酸酐修飾賴氨醯側鏈351
附加方案：用檸檬酸酐修飾賴氨醯側鏈352
方案6用溴化氰切割MetX鍵353
方案7用羥胺切割AsnGly鍵355
方案8鄰亞碘醯苯甲酸在色氨酸處切割357
方案9膠內蛋白質的考馬斯亮藍染色359
方案10膠內蛋白質的鋅/咪唑負染色361
方案11膠內蛋白質的硝酸銀染色363
方案12膠內蛋白質的S吡啶乙基化365
方案13膠內蛋白質的酶解和肽段提取367
方案14電印跡膜上的蛋白質消化369
方案15標準條件下肽段的反相HPLC372
方案16SDSPAGE肽譜作圖方法（Cleveland法）378
方案17原位SDSPAGE肽譜作圖方法（Cleveland法）380
蛋白酶和肽酶命名法383
參考文獻384
選讀文獻390
網路資源390第8章質譜在蛋白質組學中的套用391
8.1基本原理393
8.2現代離子化方法：離子如何形成400
8.3串聯質譜儀405
8.4串聯質譜儀的質量分析器結構407
8.5質譜與蛋白質分離方法聯用進行蛋白質混合物的分離和分析412
8.6體內及體外標記方法：質譜用於定量和表達蛋白質組學426
8.7利用MS數據鑑定蛋白質的搜尋引擎427
8.8總結436
實驗方案
方案1蛋白質和多肽MALDIMS分析的一般方法437
方案2反相微型層析柱的製備441
方案3固定化酶微型層析柱的製備444
方案4用於蛋白質組分析的微毛細管HPLC色譜及ESI一體化裝置的製備和使用446
方案5利用NanoLC耦聯MS/MS分析複雜蛋白質混合物455
方案6利用多維蛋白質鑑定技術分析複雜蛋白質混合物466
附加方案：用於MuDPIT分析的不溶性蛋白樣品的消化470
方案7二維色譜和質譜結合分離多肽混合物：離線方法472
方案8通過肽的半胱氨醯化捕獲蛋白質477
方案9蛋白質的同位素親和標籤480
方案10定量蛋白質組學的體內蛋白質同位素標記488
方案11利用脫水胰酶親和捕獲蛋白質494
方案12套用分子掃描器進行蛋白質組分析498
方案13利用化學印刷法進行肽質量指紋圖譜分析508
利用MS/MS進行“自上而下”的蛋白質序列分析517
氣相質子化肽段的裂解機理525
參考文獻532
網路資源542第9章用蛋白質組學方法繪製磷酸化位點圖譜543
9.1完整磷酸化蛋白的檢測和分析547
9.2通過蛋白質的裂解獲得磷酸化蛋白多肽549
9.3用MS或MS/MS來確定磷酸化蛋白的特性549
9.4用MS/MS對磷酸化多肽進行測序563
9.5對磷酸化蛋白特徵進行分析的多維策略563
9.6用於磷酸化多肽序列分析的MS和MS/MS技術的出現564
9.7總結565
實驗方案
方案1用帶有Fe(Ⅲ)和Ga(Ⅲ)的IMAC純化磷酸化多肽566
附加方案：用於樣品去鹽的微柱和NanoscaleIMAC的製備和使用569
方案2在MALDI分析之前或之後對磷酸化多肽進行鹼性磷酸酶處理570
方案3結合固定化金屬離子親和介質和MALDITOFMS直接分析方法對磷酸化多肽進行
特徵分析573
方案4離線microIMAC富集磷酸化蛋白579
方案5用μLCESIMS/MS對磷酸化多肽進行分析582
方案6MALDIMS確定酪氨酸磷酸化位點584
方案7用ESIMS確定絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化位點590
附加方案：用放射性磷酸鹽確定自發磷酸化位點594
方案8用ESIMS確定組氨酸磷酸化位點596
參考文獻599
網路資源605第10章蛋白質複合體性質的研究607
10.1mRNA的選擇性剪接對蛋白質產物活性的特定影響609
10.2用相互作用組描述生理複合體609
10.3利用酵母雙雜交分析與蛋白質組學方法研究蛋白質間相互作用611
10.4用親和捕獲技術分析蛋白質相互作用612
10.5了解多蛋白質複合體的結構618
10.6FRET分析體內蛋白質相互作用623
10.7通過測定結合常數來分析蛋白質間相互作用626
10.8蛋白質微陣列促進大規模的蛋白質研究627
實驗方案
方案1用FLAG抗原表位標記蛋白質進行蛋白質免疫共沉澱634
方案2細胞裂解液中相互作用蛋白的親和純化640
方案3多蛋白質複合體的非變性瓊脂糖凝膠電泳645
方案4BNPAGE蛋白質分析法649
方案5採用交聯法和質譜法對蛋白質複合體進行拓撲學分析657
方案6亞秒級光交聯：用水溶性金屬複合體監控蛋白質蛋白質相互作用665
方案7位點特異性蛋白質DNA光交聯法：分析蛋白質DNA和多蛋白質DNA複合體的結構
組成671
方案8用FRET法分析體內蛋白質的相互作用685
方案9用GFP嵌合體監控蛋白質蛋白質相互作用694
方案10蛋白質陣列：顯微鏡玻片的製備699
方案11蛋白質陣列：標記蛋白並通過陣列檢測來研究蛋白質蛋白質相互作用702
附加方案：如何防止產生拖尾705
方案12蛋白質陣列：標記複合體並通過陣列檢測來研究蛋白質小分子相互作用706
方案13蛋白質陣列：陣列的探針標記方法及激酶底物相互作用的放射性印跡檢測709
方案14蛋白質陣列：用“三明治法”研究複合體溶液711
參考文獻714
網路資源721第11章蛋白質組學實驗結果的詮釋：利用生物信息學發現蛋白質的結構、功能
及其相互作用723
11.1基因及其同源體的識別725
方案1利用GappedBLAST對一條長肽段進行簡單序列查找727
方案2用雙向最佳匹配法快速識別直源體734
11.2預測蛋白質的結構和功能736
11.3蛋白質在通路中的定位和蛋白質細胞功能的識別743
方案3用基因融合假說尋找功能相關聯的蛋白質——基於結構域的搜尋746
方案4操縱子的快速識別748
方案5通過系統發育譜的比較發現功能相關聯的蛋白質750
方案6從DNA微陣列數據中發現功能相關聯的蛋白質755
參考文獻759
網路資源762附錄1參考圖表765
附錄2技術773
附錄3注意事項822
附錄4供應商836
索引837

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