藥物非臨床依賴性研究技術指導原則

《藥物非臨床依賴性研究技術指導原則》是2007年10月23號國家食品藥品監督管理局發布的政策參考檔案，生效日期為2007年10月23號。

檔案發布

【發布單位】國家食品藥品監督管理局
【發布文號】國食藥監注[2007]643號
【發布日期】2007-10-23
【生效日期】2007-10-23
【失效日期】
【所屬類別】政策參考
【檔案來源】國家食品藥品監督管理局

檔案內容

藥物非臨床依賴性研究技術指導原則
(國食藥監注[2007]643號)

各省、自治區、直轄市食品藥品監督管理局（藥品監督管理局）：
為科學規範和指導藥物研究工作，國家局組織制定了《吸入製劑質量控制研究技術指導原則》、《化學藥物口服緩釋製劑藥學研究技術指導原則》、《合成多肽藥物藥學研究技術指導原則》、《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》和《藥物非臨床依賴性研究技術指導原則》5個藥物研究技術指導原則，現予發布，請參照執行。
國家食品藥品監督管理局
二○○七年十月二十三日
藥物非臨床依賴性研究技術指導原則
一、概述
藥物依賴性是指藥物長期與機體相互作用，使機體在生理機能、生化過程和/或形態學發生特異性、代償性和適應性改變的特性，停止用藥可導致機體的不適和/或心理上的渴求。依賴性可分為軀體依賴性和精神依賴性。軀體依賴性主要是機體對長期使用依賴性藥物所產生的一種適應狀態，包括耐受性和停藥後的戒斷症狀。精神依賴性是藥物對中樞神經系統作用所產生的一種特殊的精神效應，表現為對藥物的強烈渴求和強迫性覓藥行為。依賴性傾向可以在動物或人體的藥物研究過程中反映出來。
軀體依賴與精神依賴可能同時存在，也可能有分離，如興奮劑通常表現為精神依賴，軀體戒斷症狀並不明顯。
耐受性和敏感性（敏化）是中樞神經系統適應性改變的兩種不同表現形式。耐受性是指反覆使用某種藥物以後，機體對藥物的敏感性降低，需增大劑量才能產生原有的效應。與耐受性相反，敏化是指在反覆使用藥物以後，機體對藥物的敏感性提高，藥物的效應增強。成癮藥物敏化現象表現為行為反應和自主性覓藥動機增強。
已知可產生依賴性的化合物主要有阿片類、古柯鹼、苯丙胺類、大麻類、苯二氮卓類和巴比妥類及某些甾體激素類等。
本指導原則的目的，是為在藥物研發過程中進行動物潛在依賴性研究時提供技術指導。非臨床藥物依賴性研究可為臨床提供藥物依賴性傾向的信息，獲得的非臨床試驗數據有利於指導臨床研究和合理用藥，警示濫用傾向。
本技術指導原則適用於中藥、天然藥物和化學藥等新藥的依賴性研究。
二、基本原則
（一）實驗管理
依賴性研究是藥物非臨床安全性研究的一部分，根據《中華人民共和國藥品管理法》，必須執行“藥物非臨床研究質量管理規範”。
（二）具體問題具體分析
中藥、天然藥物和化學藥等的情況複雜，本文所提及的內容不可能涵蓋所有中藥、天然藥物和化學藥依賴性試驗的全部內容，依賴性研究應遵循“具體問題具體分析”的原則。
（三）整體性
藥物的研發是一個連續的、漸進的系統工程，依賴性試驗是藥物開發的一個有機組成部分。依賴性研究應結合該受試物的藥學、藥動學、藥效學、一般藥理學及毒理學試驗結果綜合分析與評價。
（四）試驗設計
試驗設計應符合隨機、對照、盲法和可重複性的原則。
三、基本內容
（一）適用範圍
1、與已知具有潛在依賴性化合物結構相似的新的化合物；
2、作用於中樞神經系統，產生明顯的鎮痛、鎮靜、催眠及興奮作用的藥物；
3、複方中含有已知較強依賴性成分的藥物；
4、直接或間接作用於中樞阿片受體、大麻受體、多巴胺受體、去甲腎上腺素受體、5-羥色胺受體、N-膽鹼受體、γ-氨基丁酸受體、苯二氮卓受體等受體的藥物；
5、已知代謝物中有依賴性成份；
6、擬用於戒毒的藥物；
7、原認為不具依賴性，而在臨床研究或臨床套用中發現有依賴性傾向的藥物。
（二）受試物
1、中藥、天然藥物
依賴性試驗擬用受試物應能充分代表擬臨床試驗受試物或擬上市藥品，因此該受試物應採用製備工藝穩定、符合臨床試用質量標準規定的樣品，並附有研製單位的自檢報告。一般採用中試樣品，並註明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件及配製方法等。如不採用中試樣品，應有充分的理由。如果由於給藥容量或給藥方法限制，可採用原料藥進行試驗。試驗中所用溶媒和/或輔料應標明批號、規格及生產廠家。
2、化學藥物
依賴性試驗的受試物應採用製備工藝穩定、符合臨床試用質量標準規定的樣品，並註明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件及配製方法等，並附有研製單位的自檢報告。所用輔料、溶媒等應標明批號、規格和生產廠家，並符合試驗要求。
（三）試驗系統
1、選擇試驗系統的依據
為了獲得科學有效的依賴性信息，應選擇最適合的動物模型或其他試驗系統。選擇試驗系統的因素包括試驗系統的藥效學反應，如敏感性、特異性和重現性；受試物的背景資料，如藥效學、藥代動力學等特點；試驗動物的種屬、品系、性別和年齡等。如果選擇特殊的試驗系統，應說明原因。
2、實驗動物
常用實驗動物包括小鼠、大鼠、猴等，一般情況下選用雄性動物，必要時增加雌性動物。通常選用大、小鼠，對於高度懷疑具有致依賴性潛能的藥物，而嚙齒類動物試驗結果為陰性，則應選擇靈長類動物。動物應符合國家有關規定的等級要求。
3、離體試驗系統
離體試驗系統可用於支持性研究（如研究藥物的活性特點和作用機理）。常用離體試驗系統主要包括：離體器官、組織、細胞、亞細胞器、受體、離子通道和酶等。
（四）給藥劑量
依賴性研究應在一個較寬的劑量範圍內進行，可根據不同的試驗方法和目的選擇不同的給藥劑量。一般採用主要藥效ED50的倍數遞增或最小有效劑量的倍數遞增，同時結合藥物的溶解性、毒性及對運動功能、學習能力和記憶能力的影響來設計劑量。每個試驗至少應設三個劑量組。
（五）給藥途徑
原則上給藥途徑應和臨床一致，儘可能增加靜脈給藥途徑。由於模型的選擇或者考慮到以後可能的非臨床濫用的不同給藥途徑，也可考慮增加其他給藥途徑。
（六）對照組
應設立陽性對照和溶媒對照組，如受試物需採用特殊的溶媒溶解，還應增設空白對照。如果受試物為較純的單一化合物，與其母核結構類似的化合物具有明顯的依賴性，則還應選擇此化合物為陽性對照藥。
（七）試驗要求
藥物依賴性研究一般包括神經藥理學試驗、軀體依賴性試驗和精神依賴性試驗三部分內容。
1、神經藥理學試驗
如有早期的體外依賴性試驗，所獲陽性試驗結果還應通過體內研究來進一步確認（除1.1的情況外）。可利用神經藥理學方法，對行為學效應和神經遞質進行測定，初步判斷受試物有無依賴性傾向，這些內容可通過藥效學試驗、一般藥理學試驗或毒理學試驗進行觀察，具體方法不再列出。
1.1 一般情況下，充分揭示藥物的藥理特性之後，還需要進行進一步潛在軀體依賴性和精神依賴性的研究。同時出現下述三種情況除外：
（1）在有效濃度範圍內，藥物與依賴性相關的分子靶點無相互作用，或者雖然觀察到藥物與相關靶點的結合，但這種結合不會引起相應的功能變化。
（2）體內研究結果未顯示出潛在依賴性。
（3）未發現此藥物具有可能與依賴有關的新的作用機制。
1.2 當潛在依賴性的類別和程度已經從體外試驗中充分暴露出來（例如一個完全μ受體激動劑），就不需再進行進一步的研究。
1.3 如果發現此藥物有可能與依賴有關的新的作用機制，則需要作進一步的研究。
2、軀體依賴性試驗
各種有依賴潛力的藥物產生軀體依賴症狀不同，沒有理想的反映軀體依賴性的單一指標，所以需要多種指標來綜合評價。生理指標可採用體重、體溫、呼吸、攝食量等；在行為學試驗中，可採用反映運動功能、學習能力、記憶能力和動機行為改變的指標。指標選擇的標準為：適宜在給藥前、給藥期間和給藥後進行動態觀察，從而有利於描述機體產生的耐受及敏化的程度、特徵及發展過程。
2.1 方法
評價藥物軀體依賴性的一般試驗方法有三種：自然戒斷試驗、催促戒斷試驗、替代試驗。無論是自然戒斷還是催促戒斷，動物都會出現一系列程度不同的表現，但不是所有戒斷症狀在一個受試動物身上都能出現。由於每種方法觀察的指標都不相同，可結合藥效學、一般藥理學表現選擇適當的方法。結合我國的具體情況，可以採用：
小鼠自然戒斷試驗
小鼠催促戒斷試驗
大鼠自然戒斷試驗
大鼠催促戒斷試驗
大鼠替代試驗
小鼠替代試驗
猴自然戒斷試驗
猴催促戒斷試驗
也可採用其他的方法，但需加以說明。
2.2 戒斷反應觀察主要注意事項
a.給藥劑量、頻率和周期應該使動物產生神經適應性反應。
b.戒斷反應的觀察應該有足夠時間和頻度，並且注意給藥前後的自身比較。
c．自然戒斷和催促戒斷兩種方式都需進行，但可在不同動物模型上進行。
d.儘可能採用儀器檢測的客觀指標。
e.有依賴性的藥物在戒斷後往往表現出反跳現象（急性藥理學作用相反的症狀），在選擇觀察指標時加以注意。
3、精神依賴性試驗
具有精神依賴性的藥物能促使用藥者周期性或連續性地出現感受欣快效應的用藥渴求，但這是一種主觀體驗，只能間接用藥物所導致的動物行為改變來反映。常選用的方法有：自身給藥試驗、藥物辨別試驗、條件性位置偏愛試驗、行為敏化試驗。
3.1 方法
猴自身給藥試驗
大鼠自身給藥試驗
大鼠條件性位置偏愛試驗
小鼠條件性位置偏愛試驗
大鼠藥物辨別試驗
小鼠行為敏化試驗
大鼠行為敏化試驗
也可採用其他的方法，但需加以說明。
3.2 精神依賴性研究主要注意事項：
c.在自身給藥試驗中需要注意藥物毒副作用相關的無應答期（動物表現出覓藥行為之前的一段時間）、增加劑量的時間點和替代的程式。
d.自身給藥試驗中，儘可能結合軀體依賴性試驗結果，設計合適的劑量，並至少變換三次劑量。
e.在條件性位置偏愛實驗中應使用平衡的實驗設計，避免動物天然傾向性影響。
4、體外依賴性試驗
（八）依賴性研究項目的選擇
為了獲得足夠的藥物依賴性信息，藥物依賴性研究內容的選擇需要參考藥效學、一般藥理學及其他毒理學試驗結果，同時至少應進行軀體依賴性試驗（自然戒斷和催促戒斷）和一項精神依賴性試驗。有強烈精神活性並擬用於改變精神神經活動的藥物，應有靈長類動物試驗數據。
（九）依賴性研究的階段性
1、對於可能存在依賴性的單一化合物：
體內神經藥理學研究應該在Ⅰ期臨床試驗前完成。在早期非臨床或臨床研究中觀察到的安全性信息可以為進一步非臨床依賴性研究提供參考。更進一步的軀體依賴性和精神依賴性試驗觀察應在Ⅱ期臨床試驗開始前完成。必要時需進行體外試驗和依賴性的機理探討。
2、對於中藥有效部位或中藥複方製劑：
中藥有效部位或中藥複方製劑成份複雜，作用靶點多，體外試驗結果參考意義有限。體內神經藥理學研究結果對於判斷是否具有依賴性有一定的意義，但其結果的評價往往有較大的難度和局限。體內依賴性試驗應作為中藥有效部位或中藥複方製劑依賴性考察的主要方法。
對於需進行藥物依賴性研究的中藥有效部位或中藥複方製劑，應在Ⅱ期臨床開始前提供全面的體內依賴性試驗的相關數據。
（十）結果分析與評價
在對所得到的非臨床試驗數據進行分析與評價時，一般應從以下幾方面進行考慮：
1、統計學差異與生物學差異的問題。統計學差異可判斷受試物對考察的試驗結果是否存在影響，但由於樣本數的限制，有時可能掩蓋真正的生物學差異，故樣本數應足夠充分，同時，還應注意對每個樣本試驗結果進行分析。對於統計學上的差異，還應結合動物的正常反應加以分析。
2、陽性藥的選擇。儘可能選擇結構相似和/或作用機理相似的合適陽性藥。
3、對動物異常行為出現的時間、持續時間及作用強度的觀察。
4、所選擇的動物是否合適，模型是否可靠。
5、分析所選擇指標的靈敏性、特異性和可靠性。
6、對具體試驗結果進行評估及整體評估。
7、比較產生依賴性的劑量與有效劑量、中毒劑量的關係。
8、分析是否存在耐受性，及耐受與依賴的關係。
9、根據藥物擬定的適應症、有效性，綜合分析繼續進行臨床研究的可行性。
總之，在對藥物潛在依賴性風險評估中，應充分利用所有的非臨床研究數據，並結合藥學、藥理學和臨床研究信息，進行科學客觀的分析和綜合評價，以判斷是否具有潛在依賴性。
四、參考文獻
藥物依賴性試驗，新藥（西藥）臨床前研究指導原則彙編（藥學、藥理學、毒理學）。中華人民共和國衛生部藥政局，1993:219-221
藥物依賴性試驗，徐叔雲主編，藥理實驗方法學，第三版，人民衛生出版社。北京，2002：251-258
Guideline on the Non-Clinical Investigation of Dependence Potential of Medicinal Products. EMEA, 2006
五、附錄
（一）軀體依賴性試驗
1、小鼠跳躍試驗（催促戒斷試驗）
（1）原理：短期內重複大劑量給藥，然後注射阿片受體拮抗劑，如受試物屬於阿片類藥物，則動物發生跳躍反應，跳躍次數可反應依賴性程度。
（2）動物：健康小鼠。
（3）實驗步驟：藥物劑量常按遞增法，有時也配合採用恆量法，給藥總量可按鎮痛ED50的倍數計算。連續給藥數天（根據藥物鎮痛作用的強弱確定給藥時間），末次藥後2h（以嗎啡為例）腹腔注射納絡酮，觀察30min內的跳躍動物數及跳躍次數，還可觀察1h內的小鼠體重減輕程度。
2、大鼠體重減輕試驗（自然或催促戒斷試驗）
（1）原理：阿片類藥物的戒斷症狀出現後，大鼠體重減輕，但非阿片類鎮痛藥和鎮靜催眠藥則無明顯作用。阿片類戒斷後大鼠體重急劇下降，以戒斷後24-48h最明顯，是考察阿片類身體依賴性的較好指標。
（2）動物：健康大鼠。
（3）實驗步驟：自然戒斷試驗每天早、晚相同時間測定大鼠體重，每次測重後按體重給藥，每天2-3次，連續給藥數周（不少於4周）。劑量根據LD50和ED50及給藥途徑制定。原則上低劑量應高於藥效學有效劑量，高劑量應儘可能高，但不能出現毒性反應。末次給藥後每天測量體重2-3次（與給藥次數相同），計算平均值，比較停藥前後不同時間的體重變化。催促戒斷試驗以劑量遞增法給藥，連續給藥1周，末次給藥後2h注射拮抗劑，在2h內每隔30min測量體重1次，比較體重下降百分率。也可同時觀察大鼠給藥後行為變化和體溫及自發活動的變化情況，並以第1次給藥至反覆給藥1周內為重要。
（4）結果評價：如戒斷後大鼠體重急劇下降，則反應受試物具有身體依賴性。
3、大鼠替代試驗（替代試驗、交叉軀體依賴性試驗）
（1）原理：阿片類藥物都有基本相同的藥理作用，給動物阿片類藥物並使之產生身體依賴性後停藥，代之以受試物，觀察動物是否發生戒斷症狀。
（2）動物：健康大鼠。
（3）實驗步驟：摻食法連續給以嗎啡使動物產生身體依賴性，5天后以生理鹽水、嗎啡或不同劑量受試物代替，每8h給藥1次，連續6次。替代前（基礎值）及替代後每隔4h測定體重1次，計算各組大鼠的體重變化，比較替代藥物組和嗎啡依賴組之間的差異。
（4）結果評價：按等效鎮痛ED50的倍數計，比較達到同樣替代程度的受試藥的劑量和嗎啡的劑量，可以確定受試藥物的身體依賴性潛力的強弱程度。對體內代謝迅速、皮下給藥不易形成依賴性的藥物，用摻食法誘發依賴性可以獲得較明確的結果。
4、大鼠攻擊試驗（自然或催促戒斷試驗）
（1）原理：大鼠對阿片類藥物形成依賴性後停藥或用拮抗劑催促，可發生戒斷症狀，易與同籠大鼠發生相互攻擊（一般停藥後72h最明顯，24h時極不明顯；具有間斷性的特點，可連續幾小時甚至幾天）。
（2）動物：健康大鼠。
（3）實驗步驟：按遞增劑量給藥，連續數天，如有依賴性，則停藥後大鼠出現體重減輕、搖體、眼瞼下垂及扭體等戒斷症狀；此時如將大鼠同居一籠，則出現嘶叫、對陣和相互攻擊現象，甚至受傷致死。一般於停藥後第3天進行試驗（將動物同居一籠），觀察1h，記錄對陣時程和嘶叫，以及攻擊和互咬次數。
(4)結果評價：本試驗可反應嗎啡成癮後腦內多巴胺能神經系統的功能。停藥後戒斷症狀是多巴胺功能亢進的表現，多巴胺受體激動劑可增強攻擊反應。所以注意排除藥物對多巴胺功能的干擾所產生的假陽性或假陰性。
5、戒斷症狀的記分評定（自然或催促戒斷試驗）
（1）原理：動物長期獲得阿片類藥物後，其中樞神經系統能產生一種適應狀態，停藥或注射拮抗劑後機體出現一系列生理干擾現象即戒斷症狀。對這些戒斷症狀的輕重程度進行綜合評分即可判斷藥物的身體依賴性潛力。
（2）動物：常用大鼠和猴。其中阿片類藥物在猴上的依賴性表現與人較接近，戒斷症狀比較明顯且易於觀察。
（3）實驗步驟：按劑量遞增法並配合恆量法給藥，也可用拮抗劑納絡酮催促戒斷。自然戒斷或催促戒斷後觀察一系列戒斷症狀，根據戒斷症狀的嚴重程度和持續時間進行綜合評分。
（4）結果評價：
戒斷症狀的綜合評分尚無統一標準，可對戒斷症狀進行全面綜合評分，也可對其中主要戒斷症狀進行綜合評分。猴戒斷症狀可分為輕、中、重、極重4個等級，每一等級的評分可根據症狀種類的多少和出現的頻率定分，但不能大於級差分值。
依賴性潛力的大小可依據等效依賴性劑量來判斷，即產生近似依賴狀態的劑量來判定，也可按相同的等效鎮痛ED50的倍數劑量來比較。
本方法同時也可進行替代試驗。可在自然或催促戒斷試驗中觀察。
附錄（二）精神依賴性試驗
1、自身給藥試驗
（1）原理：藥物的精神依賴性可產生對該藥的渴求，對覓藥行為和用藥行為具有強化效應。本試驗模擬人的行為，通過壓桿方式來獲得藥物，反映藥物的強化效應，可信度較高且可進行定量比較。
（2）動物：常用大鼠和猴。
（3）實驗步驟：
動物麻醉後無菌條件下行靜脈插管並用馬甲背心固定，連線彈簧保護套及轉軸，彈簧套內矽膠管與插管相連，轉軸使動物在籠內能自由活動，轉軸另一端與恆速注射泵及儲藥系統相連。術後常規抗感染，恢復4-7天后進行踏板訓練，使動物形成穩定的自身給藥行為。試驗過程中注意保持套管暢通。如藥物具有強化效應，動物經過短期訓練後產生穩定的自身給藥行為，能自動踩壓踏板接通注藥裝置將藥物注入體內。
（4）結果評價：
通過觀察是否形成自身給藥行為來判斷藥物是否具有強化效應；由於動物個體差異較大，建議將每隻動物自身給藥前後踏板次數變化的百分率進行組間統計。
本試驗中也可同時進行替代試驗。
通過更換受試物的劑量，比較它們在等效ED50倍數劑量條件下的踏板次數或比較產生類似踏板模式的藥物劑量，即可反映受試物的精神依賴性的強度。
本試驗設計適用於靜脈給藥，實驗中應注意藥物穩定性和配藥時間的關係。如受試藥為口服給藥，則不需進行手術，而僅將每次踏板的反應變為給一次口服製劑即可。
2、大鼠藥物辨別試驗
（1）原理：依賴性藥物使人產生的情緒效應如欣快、滿足感等，屬於主觀性效應。具有主觀性效應的藥物可以控制動物的行為反應，使之產生辨別行為效應。本試驗可準確判斷受試物是否屬於阿片類藥物，以及產生精神依賴性潛力大小。
（2）動物：常用大鼠。
（3）實驗步驟：
利用辨別試驗箱和訓練程式訓練動物正確壓桿，然後通過辨別訓練訓練動物產生穩定準確地辨別嗎啡和生理鹽水的能力。最後進行替代試驗，以不同劑量嗎啡和受試物進行替代，觀察壓桿正確率與劑量之間的關係，做出劑量-效應曲線，求得藥物辨別刺激的半數有效劑量（ED50，值越小精神依賴性潛力越大）。
（4）結果評價：
藥物辨別刺激ED50值越小反映精神依賴性潛力越大；如替代藥物不產生訓練藥物反應，則說明該藥不屬於嗎啡類藥物。本試驗不適用於阿片類拮抗劑。由於藥物辨別刺激並非完全基於藥物濫用產生，因此在評價藥物精神依賴性潛力方面不如自身給藥試驗可信，但在藥物主觀效應強度的定量比較方面有其優越性。由於動物訓練周期較長（一般3-4個月），試驗中要注意耐受性的產生。
3、條件位置偏愛試驗
（1）原理：根據巴甫洛夫的條件反射學說，如果把獎賞刺激與某個特定的非獎賞性條件刺激如某特定環境反覆練習之後，後者便可獲得獎賞特性。反覆幾次將動物給藥後放在一個特定的環境中，如藥物具有獎賞效應，則特定環境就會具有了獎賞效應的特性，動物在不給藥的情況下依然有對此特定環境的偏愛。
（2）動物：常用雄性大鼠或小鼠。
（3）實驗步驟：
試驗裝置為黑、白兩個互通的盒子，中間有可活動的隔板隔開。動物每天上午、下午（或隔天）分別給受試物和生理鹽水各一次，給生理鹽水後將動物放入一側盒子，給藥後動物放入另一側盒子，每次在盒中停留30-40min，連續訓練5天。第6天在固定時間不給藥的情況下將動物放在黑、白盒之間的活動台上，同時用隔板將黑、白盒半隔開。以動物爬到盒底的瞬間開始計時，記錄15min內動物分別在兩盒內停留的時間。
（4）結果評價：
如果動物在一側盒子內停留時間顯著延長，則表明其對伴藥盒產生位置偏愛，該受試物具有偏愛效應。以嗎啡為陽性對照藥，比較它們在等效ED50倍數劑量條件下的偏愛效應，或比較產生相似位置偏愛效應的藥物劑量，即可反映該受試物的精神依賴性潛力的強度。
本試驗的準確性取決於訓練次數和每天訓練的時間。訓練次數越多，條件聯繫越牢固；時間過短則條件聯繫不牢固，時間過長則離散度增大。