藍白篩選

實驗材料介紹

1）載體質粒和轉化受體菌株：

實驗所使用的載體質粒DNA為pBS,轉化受體菌為E. coli DH5α菌株。

E. coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。

載體質粒DNA pBS上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N端146個胺基酸的編碼序列。(這個編碼區中插入了一個多克隆位點,但並沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。)

在各自獨立的情況下,pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。

2）實驗用顯色方法

實驗中使用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)而非直接使用β-半乳糖。

X-gal 以及 β-半乳糖均為 β-半乳糖苷酶底物，但是X-gal不能誘導β-半乳糖苷酶操縱子。

實驗中使用IPTG以誘導β-半乳糖苷酶操縱子。

X-gal在β-半乳糖苷酶作用下生成深藍色產物。

1）初步篩選

載體質粒DNA pBS上帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌後只有帶有pBS DNA的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。

2）藍白篩選

當外源片段插入到pBS質粒的多克隆位點上後會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的胺基酸片段失去α-互補能力, 含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。

而沒有重組質粒的轉化子產生α-互補，在生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。

在實際操作中,藍白篩選出現是淺藍色重組子的原因是：插入小片段時，質粒仍可以表達有缺陷N-末端a肽與B連互補形成活力有缺陷的半乳糖苷酶重組子形成淺藍斑。即而出現假陰性。