插入失活法，英文名稱是insertional inactivation，用於重組DNA分子。
基本介紹
- 中文名：插入失活法
- 外文名：insertional inactivation
- 所屬科目：生物
- 對象：重組DNA分子
插入失活(insertional inactivation)
從原理上講，當外源基因(或DNA片段)插入到某一基因內的位點後, 使這個基因喪失了原有的功能叫插入失活(insertional inactivation) 。插入失活法是從不同的重組DNA分子獲得的轉化子中鑑定出含有目的基因的轉化子（篩選）的主要方法。
外源DNA片段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點後，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑑定出轉化子是重組子或非重組子。目前常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法。
1.抗性基因插入失活篩選法
根據抗生素抗性基因插入失活原理而設計的插入失活法是重組體常用的篩選方法。如非重組的pBR322質粒DNA上的四環素和氨苄青黴素抗性基因都是正常的, 表型為AprTcr。帶有這種質粒的受體菌可以在加有四環素和氨苄青黴素的雙抗性平板上生長。但是, 如果在該質粒的四環素抗性基因內插入外源片段, 就會造成四環素抗性基因失活, 變成AprTcs, 攜帶這種質粒的宿主菌可以在氨苄青黴素的平板上生長, 而不能在四環素抗性平板上生長。
2. 藍白斑篩選法
根據抗生素抗性基因插入失活原理而設計的插入失活法需要進行菌落平板的影印複製, 才能夠將所需的重組體挑選出來, 大大增加了篩選的工作量。後來, 人們設計了以β-半乳糖苷酶的產生作為顏色篩選標記的載體, 簡化了篩選程式, 提高了靈敏度。 這類載體系統包括M13噬菌體、pUC質粒系統、pEGM質粒系統。它們的共同特點是載體上攜帶一段細菌的lacZ基因, 它編碼β-半乳糖苷酶的一段146個胺基酸的α-肽, 載體轉化的受體菌為lacZΔM15基因型。這樣, 載體同宿主通過互補, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在載體的lacZ基因中插入外源DNA, 造成lacZ基因失活, 不能合成α-肽, 失去同宿主的互補, 不能形成有功能的β-半乳糖苷酶, 失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上, 含陽性重組體的細菌為物色菌落(質粒載體)或無色噬菌斑(M13噬菌體載體); 非重組體轉化的細菌為藍色菌落或藍色噬菌斑。顯色反應篩選方法比較簡單, 但是β-半乳糖苷酶的合成需要誘導。實驗中起誘導作用的是安慰誘導物--IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷), 作用底物是X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。通常是將X-gal和IPTG混合後, 塗布在固體平板的表面。
