苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，並迅速脫水生成糖醛衍生物，然後與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測定。
基本介紹
- 中文名：苯酚-硫酸法
- 原料：多糖
- 條件：硫酸的作用
- 濃硫酸：分析純，95.5%
試劑,操作,注意,
試劑
1． 濃硫酸：分析純，95.5%
2． 80%苯酚：80克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20克水使之溶解，可置冰櫃中避光長期儲存。
3． 6%苯酚：臨用前以80%苯酚配製。（每次測定均需現配）
5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰櫃中長期儲存。
6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰櫃中長期儲存。
7． 6mol/L 氫氧化鈉：120克分析純氫氧化鈉溶於500ml水。
8． 6mol/L 鹽酸
操作
1．製作標準曲線：準確稱取標準葡聚糖（或葡萄糖）20mg於500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸餾水補至2.0ml，然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻，沸水浴顯色15min以後於490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標為多糖微克數，縱坐標為光密度值，得標準曲線。
2．樣品含量測定：
①取樣品1克（濕樣）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少許5%TCA溶液研磨，倒上清液於10毫升離心管中，再加少許5%TCA溶液研磨，倒上清液，重複3次。最後一次將殘渣一起到入離心管。注意：總的溶液不要超出10毫升。（既不要超出離心管的容量）。
②離心，轉速3000轉/分鐘，共三次。第一次15分鐘，取上清液。後兩次各5分鐘取上清液到25毫升錐形比色管中。最後濾液保持18毫升左右。（測肝胰腺樣品時，每次取上清液時應過濾。因為其脂肪含量大容易夾帶殘渣。）
③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 鹽酸之後搖勻，在96℃水浴鍋中水浴2小時。
④定容取樣。水浴後，用流水冷卻後加入2毫升6mol/L 氫氧化鈉搖勻。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的樣品液，以蒸餾補至2.0ml，然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置20分鐘以後於490nm測光密度。每次測定取雙樣對照。以標準曲線計算多糖含量。
注意
（1）此法簡單、快速、靈敏、重複性好，對每種糖僅製作一條標準曲線，顏色持久。
（2）製作標準線宜用相應的標準多糖，如用葡萄糖，應以校正係數0.9校正μg數。
（4）測定時根據光密度值確定取樣的量。光密度值最好在0.1——0.3之間。比如：小於0.1之下可以考慮取樣品時取2克，仍取0.2ml樣品液，如大於0.3可以減半取0.1ml的樣品液測定。
