膠體金的發展簡史

膠體金的發展簡史（Immune colloidal gold technique），是以膠體金作為示蹤標誌物套用於抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。

基本介紹

• 中文名：膠體金的發展簡史
• 外文名：Immune colloidal gold technique
• 簡介：是以膠體金作為示蹤標誌物應
• 發展歷史：納米金即指金的微小顆粒，

簡介

膠體金技術(Immune colloidal gold technique) 膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，並由於靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金在弱鹼環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由於這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。 膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地套用於免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。

免疫膠體金技術的基本原理膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，並由於靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，形成帶負電的疏水膠溶液，由於靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。膠體金在弱鹼環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由於這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地套用於免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。用還原法可以方便地從氯金酸製備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合，因而在基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。免疫金標記技術(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用於定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。常用的免疫膠體金檢測技術（1）免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液塗片或組織切片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎上，以銀顯影液增強標記，使被還原的銀原子沉積於已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。免疫膠體金電鏡染色法可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結合，然後進行負染。可用於病毒形態的觀察和病毒檢測。（2）斑點免疫金滲濾法套用微孔濾膜（如膜）作載體，先將抗原或抗體點於膜上，封閉後加待檢樣本，洗滌後用膠體金標記的抗體檢測相應的抗原或抗體。（3）膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上後，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑後相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現已發展成為診斷試紙條，使用十分方便。原理及結果說明原理：抗體包被：單克隆抗體包被在檢測線處，抗金標抗體包被在對照線處，金標抗體吸附在固相載體無紡紗上。利用抗原抗體特異性結合的免疫反應原理，在檢測線處形成抗體-待測抗原-金標抗體複合物，在對照線處形成抗金標抗體-金標抗體複合物。結果說明陽性：測試條上下兩端先後出現紅色反應線。在吸水材料的牽引下，待測抗原在試條上向上走，首先與金標抗體結合成抗原抗體複合物，抗原抗體複合物上行到檢測線時，被測抗原的另一結合位點與包被在此處的單抗結合，形成兩個抗體結合一個抗原（雙抗體夾心）的金標複合物，因有金顆粒在此沉積，故檢測線顯紅色。未結合抗原的金標抗體上行到對照線時，與"抗金標抗體"結合，所以對照線也顯紅色。陰性：測試條上端僅有一條紅色對照線出現。待測標本中無被測抗原，測試條上只有金標抗體上行並與對照線處的抗體結合，使金顆粒沉積在此處而顯紅色。無效：測試條上下兩端均無紅色對照線出現，表明試驗失敗或測試條失效。

膠體金的發展歷史

納米金即指金的微小顆粒，其直徑在1～100nm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結合，且不影響其生物活性。由氯金酸通過還原法可以方便地製備各種不同粒徑的納米金，其顏色依直徑大小而呈紅色至紫色。

自從16世紀歐洲現代化學的奠基人、傑出的醫師、化學家Paracelsus製備出“飲用金”用來治療精神類疾病以來，納米金就開始登上了科學的舞台。

1857年英國科學家法拉第在研究道爾頓的理論時，利用氯化金還原出含納米金的溶液，發現在其中加入少量電解質後，可使溶液由紅寶石色變為藍色，並最終凝集為無色，而加入明膠等大分子物質便可阻止這種變化。儘管當時並不知道原因，但他的發現為納米金的套用奠定了科學基礎。1885年納米金溶液在美國常作為治療酗酒的主要成分；l890年Koch醫生髮現結核桿菌不能夠在金的表面存活；1890年納米金被用來治療關節炎；1935年芝加哥外科專家Edward等人發現納米金溶液能有效的減輕患者病痛，強健體質。1939年Kausche和Ruska用電子顯微鏡觀察金顆粒標記的菸草花葉病毒，呈高電子密度細顆粒狀。1971年Faulk和Taylor首次採用免疫金染色(immunogold staining，IGS)將兔抗沙門氏菌抗血清與納米金顆粒結合，用直接免疫細胞化學技術檢測沙門氏菌的表面抗原，開創了納米金免疫標記技術。

以納米金為免疫標記物的檢測技術作為現代四大標記技術之一的納米金標記技術(nanogold labelling techique)，實質上是蛋白質等高分子被吸附到納米金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是納米金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合，而且吸附後不會使生物分子變性，由於金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用於定性或半定量的快速免疫檢測方法中。由於球形的納米金粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等非共價結合，因而在基礎研究和實驗中成為非常有用的工具。

1978年，Geobegan等將納米金標記抗體用於普通光鏡下檢測B淋巴細腦表面膜免疫球蛋白，建立了光鏡水平的免疫金染色(immunogold staining，IGS)。1981年Danscher用銀顯影方法增強金顆粒的可見度，並提高了靈敏度。Holgate等人於1983年建立了用銀顯影液光鏡下金顆粒的可見性的免疫金銀染色法(immunogold-siliver staining，IGSS)，利用銀的增強作用，加大單獨金粒子在光鏡下可視粒子的半徑，增加了小顆粒金粒子的標記密度，提高了靈敏度。1986年Fritz等人又在IGSS法基礎上成功地進行了彩色IGSS法，使得結果更加鮮艷奪目。儘管如此，由於亞硝酸銀化合物是光敏性的，需要在暗室里進行標記，實驗操作非常的不便，改用非光敏的醋酸銀化合物，價格又過於昂貴，所以納米金在光鏡中的套用日漸減少。而利用納米金的高電子密度，能在電鏡下清晰的分辨顆粒，作為在透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(sEM)和螢光顯微鏡的示終物在電鏡免疫化學和組織化學中得到了廣泛套用。

1989年，Spielberg等發展了以金為標記物用於檢測愛滋病病毒抗體的滲濾試驗，確立了斑點金免疫滲濾試驗的基本技術。膠體金免疫層析(GICA)技術是20世紀90年代初建立的一種簡易快速穩定的免疫學檢測技術。Begge於1990年首次報導了一種GICA，用於孕婦尿液和血清中人絨毛膜促性腺激(HCG)的定性測定，繼而有採用該方法檢測B型肝炎病毒表面抗原HBsAg及抗HCV　IgG的報導。1993年，Kalvatchev等利用金標記的抗立克次體的多克隆抗體、單克隆抗體及IgY來檢測標本中的熱群立克次體。1995年，Muller等研製的心肌鈣蛋白（cTnT）試條，檢測下限可達0.4ng/mL。

迄今為止，金標記仍主要用於免疫組織化學中。在免疫測定中，金標記常與膜載體配合，形成特定的測定模式，典型的如斑點免疫滲濾試驗和斑點免疫層析試驗等，已是目前套用廣泛的簡便、快速檢驗方法。