腸球菌磷黴素耐藥新基因及磷黴素耐藥傳播機制研究

《腸球菌磷黴素耐藥新基因及磷黴素耐藥傳播機制研究》是依託浙江大學，由瞿婷婷擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：腸球菌磷黴素耐藥新基因及磷黴素耐藥傳播機制研究
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：瞿婷婷
• 項目類別：面上項目

項目摘要

多重耐藥菌感染的不斷增加和流行，新抗菌藥物的開發落後於耐藥發展，使磷黴素等老藥新用已成為臨床治療多重耐藥菌感染的重要手段。近年來我國臨床分離腸球菌對磷黴素耐藥性的出現和增加，使萬古黴素耐藥腸球菌（VRE）感染的治療面臨新挑戰，急需明確其機制及耐藥傳播規律。國內外有關腸球菌的磷黴素耐藥機制研究極少。本課題組前期研究中從47株VRE和150株萬古黴素敏感腸球菌（VSE）中分離到31株磷黴素耐藥菌株：24株由fosB基因造成磷黴素耐藥，但其傳播機制不清；另7株菌株目前已知耐藥基因均陰性。極可能存在新的耐藥基因。並已完成1株磷黴素耐藥VRE菌株的基因組測序。本項目將在上述研究基礎上採用高通量全基因組測序、全質粒測序、克隆表達、基因敲除、突變回補等方法，明確fosB基因移動元件，進行磷黴素新耐藥基因定位及功能驗證，系統闡明腸球菌磷黴素耐藥及傳播機制，為控制磷黴素耐藥性的不斷增加提供科學依據。

結題摘要

本課題組針對篩選到的31株磷黴素耐藥腸球菌的磷黴素耐藥機制及傳播機制進行了研究, 其中26株菌株fosB基因陽性（19株fosB陽性VRE菌株，7株fosB陽性VSE菌株），其餘5株菌株fosB基因陰性。其中篩查到的19株fosB陽性VRE菌株（18株fosB陽性屎腸球菌和一株fosB陽性鳥腸球菌）研究中發現：19株萬古黴素耐藥腸球菌，都含有vanA和fosB，對磷黴素和萬古黴素均耐藥，對利奈唑胺和替加環素均敏感。其中18株屎腸球菌屬於8個不同的ST型，以ST78為主，但都屬於醫院相關的流行克隆CC17克隆複合體。濾膜接合試驗結果確認了這19株fosB陽性菌株都能成功接合fosB基因以及vanA基因。並通過Southern雜交定位分析，其中10株菌株的fosB基因與vanA基因位於同一質粒上，且通過PCR分析，這10株菌株的fosB轉座子位於Tn1546轉座子內部，可共同發生轉移。本研究採用三代測序（單分子實時測序技術），獲得並首次報導了一個同時攜帶fosB與vanA的屎腸球菌質粒pEMA120的完整序列，並發現該質粒上含有兩個拷貝的fosB。通過三代測序，我們在鳥腸球菌中也獲得了一個幾乎相同（99.99%相似性）的質粒pEA19081，由此暗示了該質粒可以在不同的種間進行傳播。反向PCR證實，攜帶fosB的ISL3-like轉座子除了存在於質粒中，還存在一種小環結構，可能是fosB轉移過程中的過渡中間體。本研究設計了一種fosB內部酶切雜交的方法，用於已知序列質粒上fosB拷貝數的驗證及未知序列質粒上fosB拷貝數的探索。除了fosB的相關研究，本課題組對於另外5株不含fosB且接合失敗的磷黴素耐藥腸球菌菌株均完成了全基因組測序，其中兩株為三代基因測序。通過對S72和S137的全基因序列的注釋，我們發現有一個長351bp的序列，被注釋為FosX。它的胺基酸序列與已報導的單核李斯特菌中發磷黴素耐藥因子FosX，相似性53%，覆蓋度83%。但通過我們的克隆及藥敏試驗的功能驗證，這段序列與磷黴素耐藥無關。我們分別挑選了一株磷黴素敏感菌株的VRE和VSE菌株：A136和S64。利用磷黴素連續體外誘導試驗，通過對誘導前後菌株的序列分析，找到了兩個有意義的突變(G797T, G394T), 對這兩個潛在磷黴素耐藥有關的SNPs還有待進一步通過定點突變等技術進行驗證。