《福氏志賀氏菌HtrA蛋白功能研究》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由朱力擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：福氏志賀氏菌HtrA蛋白功能研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：朱力
- 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
痢疾是由志賀氏菌引起的嚴重腸道傳染病，在今後相當長時間內仍將是傳染病防治工作中的重點。前期研究發現，雙功能蛋白HtrA的功能對志賀氏菌毒力至關重要。HtrA蛋白是存在於革蘭氏陰性細菌周間質中的一種絲氨酸蛋白酶，能夠降解多種功能性蛋白質；併兼有分子伴侶功能，對細菌周間質中蛋白質質量的維持發揮著至關重要的作用。本項目計畫以福式志賀氏菌2a 2457T株為研究對象，構建htrA基因缺失突變株，通過比較蛋白質組學的方法從全局角度考察HtrA蛋白的天然底物蛋白；利用磁珠抓捕與質譜分析相結合的方法研究志賀氏菌中能與HtrA相互作用的蛋白；使用高分辨質譜方法鑑別HtrA蛋白可能存在的翻譯後修飾位點。通過上述實驗，力圖明確雙功能蛋白HtrA可能具有的新功能，發現新的毒力相關蛋白。
結題摘要
志賀氏菌引起的腹瀉病是最常見的腸道傳染病，依然是包括我國在內的多數開發中國家的重要威脅。本研究首先以福氏志賀氏菌2a 2457T株和301株為研究對象，利用λ-Red系統構建了htrA基因缺失突變株、回復株，並通過雙向電泳技術對這些菌株在30℃和37℃培養下的全細胞蛋白表達譜進行了分析，共鑑定到35個差異表達蛋白。但隨後進行的多次生物學重複實驗結果並不穩定，暗示HtrA可能對維持基因組穩定性有重要意義。Real-time PCR實驗結果證實htrA基因缺失突變株在傳代培養過程中會發生更高頻率的基因重組和片段丟失。因此，為保證差異表達蛋白篩選的可靠性，本研究又進一步構建了HtrA的誘導表達菌株，同時利用CRISPRi技術構建了HtrA的誘導沉默菌株，並利用比較蛋白質組學對不同菌株的全菌蛋白、周間質蛋白和外膜蛋白表達譜進行了深入分析，鑑定到22種差異表達蛋白，其中PhoN2、GlnH、PhoN1蛋白有可能是HtrA的尚未報導的底物蛋白。同時，滲透壓感應蛋白OsmY、外膜蛋白OmpA和OmpX的表達量均受HtrA影響，提示細菌的外膜通透性發生了改變。隨後對野生株和htrA基因缺失突變株外膜囊泡進行的提取定量、電鏡觀察、組成分析顯示，二者分泌的外膜囊泡彼此間差異很大，驗證了前述HtrA影響細菌外膜穩定的推論。在HtrA相互作用蛋白的篩選鑑定方面，由於HtrA蛋白具有蛋白酶活性，過表達時存在嚴重的自降解現象，為了抑制其降解，我們構建了酶活位點突變株進行分析；同時採用兩種不同的標籤分別標記HtrA蛋白的N端和C端，結果共捕獲到4種相互作用蛋白：AhpC、SucC、EF-Tu及Fur。在HtrA潛在翻譯後修飾形式及位點的分析方面，本研究採用高精度LC-MS/MS技術檢測了三種不同酶對HtrA酶切消化後的肽段覆蓋率，最終將翻譯後修飾可能存在的範圍縮小至83-89位胺基酸區段。隨後，我們採用丙氨酸掃描的方法對可能存在修飾的胺基酸位點C、Q、E、S逐個進行了點突變，得到了四株突變株。但雙向電泳結果未觀察到明顯的單點形式出現，仍不能確認翻譯後修飾的形式及位點。總之，本研究分離和鑑定了多種HtrA潛在底物蛋白和相互作用蛋白，證明HtrA蛋白在維持細菌基因組和外膜的穩態中發揮了重要作用。此外，考慮到外膜囊泡研究是疫苗研發中的熱點，HtrA蛋白缺失株在未來的疫苗生產中有潛在套用價值。
