瞬態可逆性Rb1敲除對毛細胞再生和存活的體內研究

《瞬態可逆性Rb1敲除對毛細胞再生和存活的體內研究》是依託復旦大學，由舒易來擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：瞬態可逆性Rb1敲除對毛細胞再生和存活的體內研究
• 依託單位：復旦大學
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：舒易來

項目摘要

調控視網膜母細胞瘤基因（Rb1）的表達為獲得耳蝸毛細胞再生的一條重要途徑。在胚胎早期敲除Rb1，可再生有功能的毛細胞；在分化後的毛細胞中敲除Rb1，其重新進入細胞周期，但逐漸死亡，認為Rb1對於分化後毛細胞的存活和功能起重要作用。前期工作比較了12種不同血清型的腺相關病毒（AAV），作為內耳基因治療的載體，第2型AAV成功轉染新生鼠毛細胞，並且對聽力無明顯影響。本課題擬構建Gfi1-cre-Rb1 flox/flox小鼠模型，特異性敲除毛細胞Rb1，使得毛細胞增殖；在新生期以納升級顯微手術作業系統行耳蝸顯微注射，轉染攜帶Rb1的2型AAV，使得毛細胞增殖後重新表達Rb1，在不同時間點行聽力及內耳形態學檢測，並行增殖後存活的新生毛細胞的功能檢測。為以瞬態可逆性阻斷Rb1途徑獲得毛細胞再生提供理論依據，也證實以AAV為載體進行內耳基因治療的可行性。

結題摘要

本課題比較了12種不同血清型的腺相關病毒（AAV），作為內耳基因治療的載體，第2型AAV成功轉染新生鼠毛細胞，並且對聽力無影響。課題擬構建Gfi1-cre-Rb1 flox/flox小鼠模型，特異性敲除毛細胞Rb1，使得毛細胞增殖；在新生期以納升級顯微手術作業系統行耳蝸顯微注射，轉染攜帶Rb1的2型AAV，使得毛細胞增殖後重新表達Rb1，在3、6周后行聽力檢查，發現未能糾正聽力，也未能使得增殖後細胞的存活。我們構建Cas9蛋白質，以gRNA（針對GFP）和脂質結合，注射入Math1-GFP新生鼠內耳。以脂質體和Cas9蛋白注射為對照，在內耳注射10天后，發現CRISPR/Cas9蛋白系統可以精準的對毛細胞進行基因編輯，效率達到20%，通過測序，證實了對GFP進行了編輯。為基因治療的進展提供了強有力的依據。