眼鏡蛇毒神經生長因子

從眼鏡蛇毒液中提取的活性成分，能夠刺激神經生長。純化的眼鏡蛇眼鏡蛇毒神經生長因子在體內和體外均無直接毒性作用。其作用可看成是對其他毒物機理的增強。

基本介紹

• 中文名：眼鏡蛇毒神經生長因子
• 外文名：cobra Nerve growth factor
• 所屬學科：生物化學與分子生物學
• 分子量：25-28KD

簡介

1948年，美國生物學家Backer驚奇的發現，將小鼠肉瘤組織移入雞胚體壁可使移植區神經節數量增加，這一發現引起了生物學界和醫學界的極大興趣，並致力於這種現象的研究。經過幾年的研究，美國科學家Levi-montalcini和Cohen等發現，不但雞胚體壁內神經節數量會受小鼠肉瘤組織的影響而增加，而且交感神經節數也會受到影響而增加，遠離移植區的神經節數亦有增加。由此他們推測，小鼠肉瘤組織可能釋放了一種可以在血液中起刺激神經纖維和神經節生長作用的因子。1954年Cohen和Levi-montalcini成功的從小鼠肉瘤-37和38中分離出了這種因子，從而證明了這種因子的存在，他們將這種因子命名為Never Growth-Stimulating Factor（神經生長刺激因子）。1956年，他們又在Dried Mocasin（Aglcistrodon Piscivorus）和Rattlesnake（CrotalusAdamantrus）兩種蛇毒中分離得到了這種刺激神經生長的因子，並且研究了它們刺激體內和體外雞胚背根神經節生長的生物活性。隨後，Cohen於1958-1959年又分別從Mocasin蛇毒和Aglcistrodon Piscivorus，Naja naja等蛇毒中也提取了這種刺激神經生長的因子，並且對它們的性質進行了初步研究。人們將這種能夠刺激神經生長的因子統稱神經生長因子（Never Growth Factor，NGF）。Cohen因對神經生長因子的突出研究貢獻獲得了1986年諾貝爾生理學和醫學獎。神經生長因子是神經系統最重要的生物活性分子之一，是一種可由多種細胞產生的能促進神經修復的多肽類因子。它與周圍神經和中樞神經的存活及發育密切相關,在神經系統、內分泌系統和免疫系統的網路調控中起重要的作用。NGF生物學功能的實現是通過NGF與效應細胞表面的NGF受體結合而介導。

它能夠維持並促進外周及中樞神經系統中部分神經元的發育和分化，營養成熟的神經元，維持其存活及正常的生理功能，並且在它們受到損傷後，促進其修復和再生。它在外周神經系統的病變及一些神經元退行性疾病，例如早老年性痴呆症、帕金森症的治療方面顯示了良好的套用前景。對眼鏡蛇毒NGF的研究多數是理論方面的研究，套用研究較少。中國對眼鏡蛇毒NGF的研究主要集中在舟山眼鏡蛇、江浙蝮蛇（Agkistrodon halys Pallas）、白眉蝮蛇毒（Agkistrodon halys ussuriensis）和尖吻蝮蛇毒（Agkistrodonacutus）蛇毒中的眼鏡蛇毒NGF，對舟山眼鏡蛇眼鏡蛇毒NGF的研究較深入。根據現有的資料分析，眼鏡蛇科蛇毒多數含眼鏡蛇毒NGF，而且含量較高； 蝰科蝰亞科NGF的分布和含量次之； 響尾蛇科和蝰科蝮亞科蛇毒中NGF含量很低。

眼鏡蛇毒NGF的生物學效應廣泛，主要通過以下幾個方面表現：（1）神經再生作用：直接於再生軸突，通過受體介導細胞內信號傳導，激活各種分化因子，發揮神經趨化作用，引導和加快軸突生長；調控雪旺細胞的增殖和分化。（2）促進神經的芽生作用。（3）保護受損的神經元：減少受損神經細胞的死亡和調控受損神經元的基因表達。（4）促進炎性反應趨化作用和再生神經的血管形成。眼鏡蛇毒NGF具有促進新血管形成作用，其機制在於眼鏡蛇毒NGF能促進神經細胞內Ca2+向細胞外釋放，Ca2+外流導致神經細胞緊張性增強，興奮性降低，使血管擴張增強，從而加大血流量；眼鏡蛇毒NGF能促進神經病損後的肌梭的細胞分化，可促進皮膚和肺的成纖維細胞的修復。有研究發現，眼鏡蛇毒NGF能增強葡萄糖引起的胰島素分泌作用，有可能是細胞自分泌或旁分泌調節的機制之一。另外，有研究發現成骨細胞存在眼鏡蛇毒NGF的低親和力受體L眼鏡蛇毒NGFR，內源性和外源性的眼鏡蛇毒NGF可與L眼鏡蛇毒NGFR結合，達到細胞間信息傳遞的作用，從而使成骨細胞發生磷酸化，成骨能力增強。

理化性質

晶體結構

董躍偉等通過離子交換色譜、凝膠過濾及FPLC色譜分離純化得到中華眼鏡蛇蛇毒神經生長因子，NGF在SDS-PAGE中為單一條帶，由兩個分子質量為13500 u的亞基組成一個完整的分子，分子量為27000 u左右，紫外吸收光譜測定顯示在279.6 nm處有一個最大吸收值，N端蛋白質序列測定顯示中華眼鏡蛇毒NGF與其它蛇毒NGF的N端蛋白序列相似。Gu等利用X射線衍射分析了通過懸滴蒸氣擴散法從眼鏡蛇毒液中純化得到的β-NGF的晶體結構，該晶體為四方空間群P4（1）2（1）2，其對映異構體為P4（3）2（1）2，晶胞參數為a=b=61.75，c=154.40A，β-NGF以二聚體形成存在於晶體不對稱單元中。劉一平等從眼鏡蛇毒中分離的NGF用於治療外周神經損傷、視神經損傷和早老性痴呆等有一定療效。

化學性質

眼鏡蛇毒NGF分為兩類：一類是分子量為25KD的由兩個相同或相似的亞基組成的二聚體，每個亞基分子量為13KD，不含糖基，亞基具有和鼠的β-NGF非常相似的性質；另一類是分子量為35KD的糖蛋白，含有10%～20%的糖基，這一類中有一部分是二聚體結構，而還有一些分子是未知的。有人認為這兩類眼鏡蛇毒NGF也有著相同的蛋白質，也許兩者的差別僅在於是否含有糖基。

SDS電泳相對分子質量標準曲線

Angeletti發現眼鏡蛇毒NGF由兩個同源亞基構成，每個單位含117個胺基酸，分子量大約為28kD，眼鏡蛇毒NGF等電點偏低，無蛋白水解酶或其它酶的活性。具有很高的穩定性，在一些極端條件，如0.1N HCl、0.1N NaOH存在下也不失活，對一些常見的蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶具有抵抗能力。在相同蛋白質濃度下，眼鏡蛇毒NGF能引起小雞胚胎背側根神經節軸突最大限度的生長，但較少的軸突生長和較大的細胞移行。

眼鏡蛇毒神經生長因子電泳圖

眼鏡蛇毒神經生長因子電泳圖圖冊參考資料。

分離純化

已有多種從蛇毒中提取NGF的層析法報導。Hogue-Angeletti等人於1968年利用四步層析法第一次從蛇毒中提取到了NGF，每步的色譜填料分別為Sephadex G-I00，DEAF cellulose，SephadexG-75 and CM-Cellulose。測得的活性物質的分子量為20-40kD，說明他們此次得到的並非純品。1976年他們提出了兩步純化程式，即，凝膠過濾色譜連線一陽離子纖維素色譜的方法，但其中採用了透析脫鹽的過程，大大的延長了純化時間，而且增大了眼鏡蛇毒NGF的活性損失。採用這種方法得到的蛋白產率為0.15%，耗用的色譜分離時間約為310hr。同年，Furukawa用凝膠過濾柱+離子交換柱+凝膠過濾柱的方法從中華眼鏡蛇蛇毒中分離出了眼鏡蛇毒NGF，並證明了蛇毒中所含有的NGF的等電點約為7.02。採用這種方法得到的蛋白產率為0.45%，耗用的色譜分離時間約為150hr。1985年Khamiclov等人用凝膠色譜+離子交換色譜+G-75Superfine Sephadex薄層色譜等電聚焦法從眼鏡蛇蛇毒中純化了眼鏡蛇毒NGF。1986年Siiguir等人從vipera berus berus venom中得到了純化的眼鏡蛇毒NGF，採用的工藝為Sephadex G-100凝膠柱+DEAESephadex A-50離子交換柱+PBE 11層析聚焦法。他們所得的眼鏡蛇毒NGF蛋白的產率為0.41，耗用的色譜分離時間約為170hr。

凝膠過濾色譜分離

提純的方法由實驗條件和技術決定。Furukawa等從眼鏡蛇科的Naja naja atra中提取眼鏡蛇毒NGF時採用了凝膠過濾，低壓凍乾，離子交換層析和透析法。Siigur等使用單克隆抗體親合層析從10多種蛇毒中獲得了眼鏡蛇毒NGF。Kostiza等用陽離子交換色譜，真空冷凍乾燥法和RPLC色譜從蛇毒中分離了眼鏡蛇毒NGF。雖然使用不同的純化方案，來自不同腺體的蛇毒純化得到的眼鏡蛇毒NGF產率有所不同，但大致都為0.2%～0.5%（w/w），而來自小鼠頜下腺的NGF產量僅為0.002%～0.0025%，相對而言，眼鏡蛇毒NGF產率很高。利用PC-12細胞系可以很好地檢測眼鏡蛇毒NGF的生物活性，因此，這個檢測系統被用來篩選層析法得到的眼鏡蛇毒NGF。PC-12細胞培養檢測必須保證沒有細胞毒性物質，蛇毒中的磷脂酶A2、細胞毒、心臟毒、多肽外切酶、多肽內切酶、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶等都是影響細胞培養檢測的有毒或有害物質。Kostiza等用PC-12細胞檢測眼鏡蛇毒NGF，發現即使高度稀釋的蛇毒溶液也能檢測出來，但前提是提純的溶液中細胞毒性物質必須失活。

色譜分離工藝流程

從蛇毒中提取NGF有分子篩層析、離子交換層析、親和層析和基因工程製備等方法。分子篩層析，離子交換層析是最常用的方法，但缺點是步驟繁瑣，蛋白的活性損失大。至於是先進行還是後進行分子篩層析要依具體情況而定，部分眼鏡蛇毒NGF分離過程還要其他方法輔助。從分離介質的化學穩定性、商品的可獲得性和商品成本方面考慮，具有實際用途的方法則是比較經典的、且在文獻上大量使用的凝膠過濾十離子交換+凝膠過濾模式。但是這種方法存在這以下兩個致命的弱點：（1）第一步的凝膠過濾過程中一般都需要100多個小時，不但操作時間長，而且蛋白與介質的長時間接觸，使得所需的目標蛋白的活性有可能降低。（2）在第一步中採用的凝膠過濾法，由於凝膠介質吸附容量較小，使得樣品的處理量很小，因此，只能用於實驗室少量樣品的製備，很難放大到中試和生產規模上。

用層析方法可分離出多種眼鏡蛇毒NGF，例如吳鵬等採用DEAE-Sepharose F.F和Sephadex G-50二步柱色譜工藝從舟山眼鏡蛇（Najanaja atra）蛇毒中分離得到電泳和色譜純的眼鏡蛇毒NGF。由於眼鏡蛇毒NGF在粗毒中的含量較低，加上一些未知的因素，使得它的分離純化成為一件非常困難的工作，經過反覆層析導致眼鏡蛇毒NGF失活，得率較低，利用親和層析一步法分離眼鏡蛇毒NGF是今後分離工作的方向。鑒於眼鏡蛇毒NGF在蛇毒中含量少，而眼鏡蛇毒NGF在臨床套用中存在的巨大潛在價值，科學工作者探索利用基因工程的方法獲得具有生物活性的眼鏡蛇毒NGF，郭麗英等已經將江浙蝮眼鏡蛇毒NGF的基因轉入大腸桿菌和家蠶幼蟲，並表達出具有生物活性的眼鏡蛇毒NGF，基因工程製備眼鏡蛇毒NGF將是今後研究工作的重點之一。

檢測

檢測是分離純化、功能研究和套用研究的基礎。眼鏡蛇毒NGF的檢測包括純度檢測和活性檢測，純度檢測採用蛋白質純度檢測的常規方法進行，例如SDS-PAGE、色譜法等。活性檢測主要有2種方法：雞胚背根神經節組織培養檢測法和PC12細胞培養檢測法。前者是眼鏡蛇毒NGF活性測定的經典方法，實驗條件要求簡單。該法最早由Levi-Montalcini於1954年創立；而PC12細胞培養檢測法靈敏性高，但實驗條件要求較高，所以雞胚背根神經節組織培養檢測法仍是最為常用的眼鏡蛇毒NGF活性測定方法。

雞胚背根神經節法測定NGF生物活性

方法一：雞胚背根神經節組織培養檢測法是活性檢測的經典方法。取8d齡雞胚背根神經節，接種於塗有鼠尾膠的細胞瓶中，貼壁後，加入不同濃度眼鏡蛇毒NGF，同時設空白對照，37℃5%CO2孵箱培育24 h，倒置顯微鏡下觀察，以引起神經節樹突生長達7 nm 的最低濃度為一個眼鏡蛇毒NGF活性單位，乘稀釋倍數，換算成每mL 含活性單位數，再使用Lowry 法測定蛋白含量。根據測得的眼鏡蛇毒NGF活性單位和蛋白含量，計算出每mg 蛋白所含活性單位數，即為比活性。方法二：大鼠腎上腺嗜鉻細胞（pheochro-mocytoma cells，PC12）培養檢測法，此法的理論依據是眼鏡蛇毒NGF能在無血清培養液中與PC12細胞上的受體結合，使PC12細胞長出軸突向神經細胞方向分化。兩種檢測方法的簡單比較：方法一優點是特異性高，實驗條件簡單；缺點是操作複雜，干擾因素多（自備雞血漿、雞胚浸液和鼠尾膠原，易污染），實驗結果主觀，重複性差，一般用於定性測定。方法二優點是靈敏性高，操作簡單，干擾因素少，實驗結果客觀，重複性好，用於定性和定量分析；缺點是實驗條件要求高（眼鏡蛇毒NGF中細胞毒性物質須失活，需要合適的PC12細胞亞系等）。

空間結構

眼鏡蛇毒神經生長因子含有α、β、γ3個亞基，可表示為α2βγ2。其中α和γ亞基的作用是維持β亞基的穩定性，調節其生物活性。而β亞基由2條各含有188個胺基酸殘基的相同肽鏈組成，是神經生長因子的活性亞單位，發揮全部生物學效應。眼鏡蛇毒NGF通過與細胞表面的兩類受體結合而發揮作用。但兩類受體在親和力、穩定性、分布和生物學功能等方面有所不同。一類是高親和力的酪氨酸激酶受體（TrkA），它是由原癌基因TrkA編碼的蛋白酪氨酸激酶，是眼鏡蛇毒NGF的功能性受體。另一類是低親和力的p75受體（p75NTR），屬於腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。二者均為跨膜蛋白受體，參與調節以神經元為主的某些細胞的生長、分化、存活、修復以及凋亡等多種生物學效應。研究表明，二者間的信號轉導及生物學效應既相互協同又彼此拮抗，既緊密聯繫又有顯著區別。TrkA一般介導“正性”信號，TrkA的激活會導致一系列磷酸化級聯反應，促進神經元生長、存活和分化；而p75NTR則具有多種生物學效應，除可促進神經元存活、生長外，還可誘導神經元凋亡、抑制神經元軸突生長以及參與細胞周期的調節，即可介導“正性”和“負性”兩種效應，但以介導“負性”促凋亡效應為主，這與p75NTR所在細胞的類型、生理與功能狀態、發育階段以及局部環境有關。

眼鏡蛇毒NGF蛋白單體三級結構

分子量為140000的糖蛋白，由α、β、γ三種肽鏈按α2βγ2的比例構成，肽鏈間以共價鍵結合；人的眼鏡蛇毒NGF受體基因位於第17號染色體，為單拷貝基因，有6個外顯子，第一個外顯子編碼信號肽，第二、三個外顯子編碼膜外區，第四個外顯子編碼跨膜區，第五、六個外顯子編碼胞內區。經過幾十年的研究，眼鏡蛇毒NGF的蛋白結構已基本了解清楚，三維結構已從其晶體圖像證實。它由兩個相同的亞單位組成，亞單位由三個β轉角連線的三對反平行β摺疊組成。亞單位間通過“半胱氨酸結點”連線。發現的眼鏡蛇毒NGF均為糖蛋白，其構型至關重要的胺基酸在神經營養素家族中保守，不同於眼鏡蛇毒NGF的特性由可變區的胺基酸決定，可變區的變化不影響它們的基本結構，但對特異性受體的結合起決定作用。眼鏡蛇毒NGF單體保守結構主要包括兩對反向平行的β鏈，β鏈構成了眼鏡蛇毒NGF長而扁平的形狀，其中包括六個半胱氨酸殘基，組成三對二硫鍵，這三對二硫鍵為組成眼鏡蛇毒NGF的結構提供剛性支持，其中的兩對及其相連的殘基形成了一個環狀結構（Cys58-Cys108，Cys68-Cys110），第三對（Cys15-Cys80）穿過此環形成緊密包裹的“半胱氨酸結”，這種結構使得兩個眼鏡蛇毒NGF單體中的β鏈互相包裹，組成一個較大的由芳香族胺基酸殘基構成的疏水單體交界面，沿著兩個單體平面的軸形成了眼鏡蛇毒NGF二聚體的活性分子，組成疏水面的胺基酸殘基對眼鏡蛇毒NGF三維結構的形成起了主要作用，還有一些胺基酸殘基通過氫鍵和鹽鍵，輔助支持三維結構的穩定性。當與高親和力受體結合時，保守結構，尤其是β3β4鏈形成配體受體複合物起到支持作用，因為這種結合需在眼鏡蛇毒NGF二聚體的疏水面上進行。眼鏡蛇毒NGF結構中位於轉角Ⅰ區和Ⅴ區的正電荷區參與p75的結合，該區域由至少3個帶電荷的賴氨酸殘基組成。眼鏡蛇毒NGF與TrkA的結合需要至少眼鏡蛇毒NGF分子中5個不同區域參與，結合的位點分布於眼鏡蛇毒NGF的二聚體，並集中在眼鏡蛇毒NGF二聚體一邊。整個結合位點呈一平面並與眼鏡蛇毒NGF的二重旋轉軸基本平行。由於眼鏡蛇毒NGF二聚體呈二重旋轉軸對稱，眼鏡蛇毒NGF有兩個TrkA的結合位點，有利於TrkA受體二聚體的形成。

眼鏡蛇毒神經生長因子胺基酸序列參考資料。

眼鏡蛇毒神經生長因子胺基酸序列

TrkA主要由一種跨膜酪氨酸激酶gp140 Trk組成，它是原癌基因Trk的產物。當眼鏡蛇毒NGF與TrkA結合後，在眼鏡蛇毒NGF作用下gp140 Trk能夠自我催化酪氨酸殘基磷酸化，從而增強自身的酪氨酸激酶活性，這是眼鏡蛇毒NGF發揮生物效應的始動階段，活化後的Trk A將接受到的信號向細胞內傳送則需通過ras原癌基因編碼蛋白p21ras，隨後通過RAS/MAPK信號通路的激活，影響基因的轉錄和翻譯，表現為對細胞生長的調控。眼鏡蛇毒NGF與Trk A之間的相互作用是影響惡性腫瘤細胞生長、擴展和播散的重要因素。眼鏡蛇毒NGF低親和力受體p75參與介導細胞凋亡。在Trk A受體通路未被激活的情況下，p75在促進細胞凋亡的過程中尤為重要。當過量表達p75時，p75部分活化導致細胞凋亡，Trk A處於被抑制狀態；在與眼鏡蛇毒NGF結合後p75被激活，表現出與Trk A相互作用，解除了對它的抑制，從而表現出TrkA的高親和能力，發揮TrkA高親和受體作用，啟動了促細胞存活信號。在細胞水平上，眼鏡蛇毒NGF與p75結合可導致幾條細胞內信號通路的活化，包括NF-κB、Jun激酶激活以及激活酸性鞘磷脂酶產生神經醯胺等。NF-κB通路可促進細胞存活，而Jun激酶通路和鞘磷脂的水解則促進細胞凋亡。

廣西眼鏡蛇眼鏡蛇毒NGF的克隆結果為：RT2PCR擴增得到單一條帶，其大小與預期一致，800 bp左右。將該條帶克隆至pMD218T載體中，序列分析結果顯示我們所得到的cDNA長802 bp，其中編碼框有723 bp，編碼由241個胺基酸組成的眼鏡蛇毒NGF前體。其前體N端18個胺基酸組成的信號肽，很好的吻合21/13信號肽切割位點識別規則。K124和R125位點是潛在的蛋白質加工位點，加工為由119個胺基酸構成的成熟蛋白質。另外145~147位的NKT為潛在的N端糖基化位點。將不同胺基酸相同的化學性質計算在內，同源性更高。其中在prepro區域中，由18個胺基酸殘基構成的信號肽及功能域Ⅰ和功能域Ⅱ被認為對眼鏡蛇毒NGF前體加工、切割、摺疊形成有生物活力的眼鏡蛇毒NGF至關重要。另外，還有一些重要的胺基酸為眼鏡蛇毒NGF維持其空間結構、保證其生物活力所必需，尤其是6個特徵性的半胱氨酸。廣西眼鏡蛇眼鏡蛇毒NGF在這些重要的區域及胺基酸與已知的眼鏡蛇毒NGFS具有嚴格的保守性。

毒理

毒蛇蛇腺中高濃度眼鏡蛇毒NGF的存在預示著眼鏡蛇毒NGF可能與毒蛇毒性有關，或是直接的毒性，或是間接的毒性。1970 年，Angeletti等實驗發現純化的眼鏡蛇眼鏡蛇毒NGF在體內和體外均無直接毒性作用。但是這不能排除眼鏡蛇毒NGF對毒蛇毒性的影響，提示人們對眼鏡蛇毒NGF間接毒性作用重要性的研究。後來人們發現，眼鏡蛇毒NGF可與其它毒素髮生協同作用。眼鏡蛇毒因子（Cobra venom factor）與眼鏡蛇毒NGF即可發生協同作用，當眼鏡蛇叮咬後，眼鏡蛇毒因子入侵，進入血液，使循環系統中C3、C5補體成分大量減少，形成過敏毒素C3a、C5a。這些過敏毒素除了趨化作用外，還能促進肥大細胞和嗜鹼性粒細胞介質的釋放。而C3a在眼鏡蛇毒NGF的協同作用下劇烈引發嗜鹼性粒細胞的脫顆粒作用，遠遠強於它們的單獨作用，從而帶來強烈的免疫系統過敏反應。因此，眼鏡蛇毒NGF的作用可看成是對其他毒物機理的增強。

眼鏡蛇毒NGF可以使嗜鹼性粒細胞發生過敏性的脫顆粒反應，使其具有一定的免疫學功能甚至一定的毒性。Kositza 等研究了純化的Naja naja atra眼鏡蛇毒NGF在全血、離體粒細胞、血小板和血管活動中的活性。發現眼鏡蛇毒NGF能誘導全血細胞中血漿外滲和組胺釋放。眼鏡蛇毒NGF引起組胺分泌上升，同時可能促進或拮抗炎症反應。前者是由於組胺作用於毛細血管壁受體使毛細血管通透性上升，其效應可被H1阻抗劑有效抑制；後者是通過H2受體引起靶細胞cAMP水平上升，從而抑制靶細胞的組胺的釋放而實現。組胺可以抑制免疫系統，這是組胺抗炎症的一個原因。因此，眼鏡蛇神經生長因子的非神經元效應可能用來解釋在炎症反應時的免疫調製活動。

生理功能

分布

眼鏡蛇毒NGF在體內可由不同來源的細胞分泌，包括神經細胞和非神經細胞。在中樞神經系統主要分布於膽鹼能神經元，尤以海馬齒狀回的顆粒細胞層及CA1~CA3區的錐體細胞層以及大腦皮層中含量最高。在外周神經分布在有交感神經或感覺神經支配的組織中。在這些組織中，靶區NG-FmRNA的含量與交感神經或膽鹼能神經的分布密度呈正相關。

作用機制

眼鏡蛇毒NGF在損傷早期套用能減輕神經纖維發生的潰變，從結構和功能上促進受損神經的再生修復；而持續在損傷局部注射眼鏡蛇毒NGF，術後30天則發現神經纖維大量再生，結構紊亂，軸突消失，未見新生郎氏結，再生神經纖維數量已明顯超過對照組和術後10d組水平（P<0.01），行為學評價結果支持組織學的改變：術側肢體在術後16d左右出現足底刺激反應消失，肢體癱瘓的改變。說明眼鏡蛇毒NGF能持續刺激神經纖維大量再生，再生的神經纖維結構紊亂，已不具有正常的組織結構，致使神經纖維的傳導功能喪失。有關資料顯示：有限的內源性眼鏡蛇毒NGF在周圍神經損傷再生中沒有明顯的作用，而給以超生理劑量的外源性眼鏡蛇毒NGF能顯著改善神經損傷後的功能和神經化學的缺陷，因此認為周圍神經受損後，給以高劑量的眼鏡蛇毒NGF可能獲得較好的療效。

眼鏡蛇毒NGF通過與神經元細胞膜表面受體結合而發揮作用，發現有兩類受體：一種是結合配基後又很快釋放的低親和力受體（L NGFR），低親和力受體系一相對分子質量為75 ku的跨膜糖蛋白，稱P75（L NGFR）。所有眼鏡蛇毒NGF家族成員的低親和力結合都是通過P75（L NGFR）。現已知P75（LNG-FR）具備一種誘導細胞凋亡的作用，由於結合了眼鏡蛇毒NGF而被抑制。另一種是結合後緩慢釋放的高親和力受體（H NGFR），該受體是由原癌基因酪氨酸激酶（TrK）編碼的蛋白質構成，包括3種類型（TrKA、TrKB和TrKC）。眼鏡蛇毒NGF的高親和力受體是TrKA，相對分子質量為140 ku，稱為P140（TrKA），可引導細胞的神經營養效應，TrKB是BDNF和NT24/NT25的高親和力受體，相對分子質量為145 ku，稱P145（TrKB）。TrKC是NT23的高親和力受體，相對分子質量約為145 ku，稱P145（TrKC），NT23在高濃度時還可結合TrKA、TrKB和TrKC。TrKs和眼鏡蛇毒NGFs結合後，Trk被激活，自身發生酪氨酸磷酸化，同時引起一系列反應，如激活細胞內的信號傳遞系統、激活細胞分裂蛋白激酶及激活並誘導某些基因表達。

對神經系統的作用

在胚胎髮育期，眼鏡蛇毒NGF為神經元發育所必需。眼鏡蛇毒NGF能誘導神經纖維定向生長，刺激胞體和樹突的發育，增加神經纖維支配區的密度，促進神經元的分化發育，使感覺神經、交感神經節數目增加、體積增大、纖維延長，促進蛋白質合成，糖和脂類代謝，促進亞細胞器的發育，尤其影響與神經分化密切相關的結構和功能蛋白的表達與修飾。在胚胎髮育早期，中樞眼鏡蛇毒NGF的含量決定膽鹼能神經的密度。但在無膽鹼能神經支配的小腦和下丘腦，眼鏡蛇毒NGF含量也較高，表明除膽鹼能神經外，眼鏡蛇毒NGF對其他類神經元也有營養作用。在神經元發育成熟期，眼鏡蛇毒NGF和眼鏡蛇毒NGF受體明顯減少，主要效應神經對眼鏡蛇毒NGF的依賴性也顯著降低，只有部分交感神經元仍需依賴眼鏡蛇毒NGF存活。

眼鏡蛇毒NGF能維持神經損傷後軸突再生的需要，刺激軸突發芽和突觸形成，促進神經細胞的再生。當眼鏡蛇毒NGF的效應神經元受損時，可引起相應區域的眼鏡蛇毒NGF和眼鏡蛇毒NGF受體表達明顯增加。眼鏡蛇毒NGF能通過抑制自由基的損害和防止組織內鈣離子濃度的升高來維持鈣離子的穩定狀態，從而保護神經元免受興奮性胺基酸等引起的損傷。另外，眼鏡蛇毒NGF還能通過抑制P75介導的細胞凋亡等機制減輕或防止繼發性病理損害的發生。中樞膽鹼能神經元為眼鏡蛇毒NGF依賴性神經元。眼鏡蛇毒NGF可引起中樞膽鹼能神經元增生和存活時間延長，有效保護膽鹼能神經元受損傷所致的神經變性，改善學習和認知功能。同側腦室注入眼鏡蛇毒NGF可以防止內隔核膽鹼能神經元的死亡，並明顯減輕隔核、海馬膽鹼乙醯化酶降低的程度。

轉鐵蛋白（Transferrin，Tf）受體存在於大腦毛細血管內皮細胞膜上，當Tf與其結合以後，可介導Tf透過血腦屏障（Blood-brain barrier，BBB）。張春燕等建立AD大鼠模型，將眼鏡蛇毒NGF與Tf通過生物素（Biotin）-親和素（Avidin）系統偶聯，形成眼鏡蛇毒NGF-T，f由鼠尾靜脈注入。結果顯示：眼鏡蛇毒NGF-Tf能成功穿透BBB，一方面眼鏡蛇毒NGF作用於基底前腦膽鹼能神經元的眼鏡蛇毒NGF受體，有效防止膽鹼能神經元變性和膽鹼乙醯轉移酶活性下降，促進功能恢復，另一方面眼鏡蛇毒NGF促進未損傷纖維側支發芽到達失神經支配的海馬，有效改善學習記憶和方向辨別障礙。大量的研究表明凋亡參與阿爾茨海默病（Alzhemi er dis-ease，AD）患者神經元的變性丟失。β-澱粉樣蛋白（Amyloidprotein，Aβ）是腦內細胞外老年斑的主要成分，AD病人的Aβ含量明顯高於正常。在體外培養和轉基因小鼠試驗中Aβ作為一種細胞毒性物質可引起神經細胞的壞死和凋亡。何艷通過Aβ毒性片斷Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡建立體外AD細胞模型，檢測眼鏡蛇毒NGF干預下細胞凋亡的變化。發現眼鏡蛇毒NGF能部分對抗PC12細胞凋亡，當神經生長因子被剝奪，可引起PC12細胞凋亡。眼鏡蛇毒NGF能夠保護PC12細胞因血清撤退所致的凋亡，其機制與激活TrkA-PI3-K（磷脂醯肌醇3-激酶，phosphatidylinostol3-kinase）/Akt（蛋白激酶B，PKB）途徑，並促進Bcl-2的表達和抑制caspase-3的激活相關。

眼鏡蛇毒NGF對神經節的刺激作用

眼鏡蛇毒NGF在抑制細胞凋亡的作用方面其他學者也做了大量的研究。文亮等通過四血管閉塞法建立大鼠全腦缺血-再灌注模型，通過側腦室注射眼鏡蛇毒NGF，免疫組織化學法檢測凋亡相關因子P75NTR、Bcl-2、Bax的表達，TUNEL法檢測神經元凋亡，發現再灌注後海馬CA1區P75NTR、Bax的表達增加，推測眼鏡蛇毒NGF的抗凋亡作用可能通過其受體來調節。李強等[9]試驗發現眼鏡蛇毒NGF對小腦皮層神經細胞凋亡有明顯抑制作用。

杜秀娟等用新生大鼠視網膜神經細胞體外原代培養技術，加入不同濃度的眼鏡蛇毒NGF進行培養，觀察視網膜神經節細胞（retinalganglion cells，RGCs）在體外的存活時間，比較實驗組和對照組的RGCs個數、胞體直徑和軸突長度。結果顯示眼鏡蛇毒NGF能促進體外視網膜神經細胞和RGCs的存活及軸突的伸長，有保護視神經的作用。

桑延智等用鏈脲佐菌素製作糖尿病大鼠動物模型，觀測糖尿病大鼠視網膜的超微結構變化，發現給予眼鏡蛇毒NGF後大鼠視網膜血管、感光細胞和RGCs的超微結構有明確的改善作用。Eugenia等發現眼鏡蛇毒NGF能顯著抑制糖尿病患者背根神經節細胞的減少，並能增強神經纖維的再生。

對免疫系統作用

許多免疫細胞上都存在NGF受體，眼鏡蛇毒NGF能增強特異性和非特異性免疫反應，通過影響免疫細胞的活性調節免疫系統的功能。張學榮等給顱腦創傷大鼠模型腹腔注射眼鏡蛇毒NGF，發現大鼠脾細胞體外增殖能力、脾細胞分泌IL-2能力、外周血ANAE陽性細胞百分比和腹腔巨噬細胞吞噬活力顯著增高。陳麗華等臨床上用眼鏡蛇毒NGF與膠原蛋白聯合治療急性感染控制後痤瘡病人，發現兩者聯用可提高痤瘡皮膚的免疫功能，加速皮膚修復，不留疤痕，無色素沉著，美容效果明顯提高。

對血液和血管的作用

純化的眼鏡蛇毒NGF無論在體內或體外都被證實沒有直接的毒性作用。程勃超等猜測眼鏡蛇毒NGF與磷脂酶A2產生協同作用，分解脂肪酸，釋放花生四烯酸，產生前列腺素、前列環素、血栓素等，這些產物作用於局部或全身，破壞細胞膜結構，引起大量溶血。Kostiza等發現局部注射眼鏡蛇毒NGF後，由於血管通透性增高導致血漿外滲，造成毒性物質釋放。加入組胺拮抗劑可以降低該反應，表明內源性組胺參與了對眼鏡蛇毒NGF的回響。

對生殖系統作用

徐天瑞等證明，中華眼鏡蛇（Naja naja atra）毒液中的眼鏡蛇毒NGF對大鼠雄性生殖系統有影響。眼鏡蛇毒NGF改善雄性大鼠的附睪精子活力，增加交配雌性大鼠的妊娠率和胎兒數目，改善了雄性大鼠的生育力。眼鏡蛇毒NGF對睪丸有保護效應，給藥眼鏡蛇毒NGF-棉酚的雄性大鼠的促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）的血清水平比給藥棉酚的雄性大鼠的低，眼鏡蛇毒NGF抑制了棉酚對睪丸的有害效應，但機制有待更進一步的研究。

醫學作用

抗腫瘤

眼鏡蛇毒NGF通過抑制腫瘤細胞的有絲分裂促進腫瘤向良性方向分化。報導眼鏡蛇毒NGF對一些神經和非神經腫瘤如前列腺癌、肺癌、乳腺癌等有抗腫瘤作用。在人類小細胞癌，眼鏡蛇毒NGF可抑制癌細胞的增殖，阻止克隆生長，在體外可削弱它們的入侵能力。研究表明眼鏡蛇毒NGF可通過細胞毒作用、增殖抑制、抑制腫瘤血管形成等多種機制產生抗腫瘤作用，對體外培養的前列腺癌人白血病細胞株K562、人胰癌細胞株JF305、人肺癌細胞株AGZY-83a和人胃癌細胞株MG-803均具有細胞毒性和生長抑制作用。

許多研究表明：腫瘤細胞凋亡與細胞周期的特異性有一定的聯繫。許多抗腫瘤藥物正是通過誘導細胞周期特異性細胞凋亡，達到治療目的。不同藥物誘導的細胞凋亡可發生在細胞周期的不同時相，當細胞凋亡發生時，細胞先被阻滯在細胞周期的某一時相，然後發生細胞凋亡。經流式細胞儀檢測發現，眼鏡蛇毒NGF處理後的CNE-2細胞，細胞周期發生了變化。其中G0/G1期細胞增多，S期和G2/M期細胞數減少，使G0/G1期細胞堆積，說明眼鏡蛇毒NGF使CNE-2細胞阻滯在G0/G1期。凋亡細胞的百分率隨著眼鏡蛇毒NGF濃度的增高而逐漸增高，凋亡率與對照組相比差異有顯著性（P<0.05或0.01），通過誘導凋亡抑制腫瘤細胞的生長。眼鏡蛇毒NGF抗腫瘤活性與誘導腫瘤細胞凋亡有關。說明眼鏡蛇毒NGF具有一定的抗腫瘤作用。

眼鏡蛇毒神經生長因子對HSC-T6細胞生長形態的影響圖冊參考資料。

眼鏡蛇毒NGF對HSCT6細胞生長形態影響

眼鏡蛇毒神經生長因子對PC12細胞生長形態的影響圖冊參考資料。

眼鏡蛇毒NGF對PC12細胞生長形態的影響

Kukhtina等發現從眼鏡蛇Najakaouthia毒液中獲得的眼鏡蛇毒NGF在無血清培養基中比小鼠頜下腺眼鏡蛇毒NGF更能有效防止PC12細胞的死亡；Khafizova 等用鼠類黑素瘤KML 細胞進行的體外實驗表明中亞眼鏡蛇Naja oxiana 眼鏡蛇毒NGF對癌細胞作用的性質類似於小鼠眼鏡蛇毒NGF，具有抗腫瘤活性，但是強度次於它，該眼鏡蛇毒NGF增加了無毒的蛇毒蛋白質具抗腫瘤活性的目錄。

藥劑學研究

劉秀文等用125I 標記舟山眼鏡蛇毒NGF，研究了125I-眼鏡蛇毒NGF在大鼠體內的代謝動力學，發現坐骨神經放射性強度明顯高於血清，提示眼鏡蛇毒NGF與坐骨神經結合併發揮作用。楊坷等用131I標記舟山眼鏡蛇毒NGF，對兔眼結膜下和玻璃體內分別進行注射給藥。結果表明，結膜下注射眼鏡蛇毒NGF後兔眼玻璃體內藥物濃度在6h 達高峰，而玻璃體內注射在1h達高峰並能在眼內達到較高的藥物濃度並維持較長時間，說明玻璃體內給藥好於結膜下給藥。

對動物坐骨神經損傷模型的研究許多藥效研究都是在動物坐骨神經損傷模型上進行的，眼鏡蛇毒NGF的效用也是確定的。研究者所用的眼鏡蛇毒NGF來源多樣，但都從蛇毒中分離而來。劉寧宇等發現，大鼠坐骨神經損傷後乙醯膽鹼酯酶（AchE）和酸性磷酸酶（ACPase）活性明顯下降，給藥舟山眼鏡眼鏡蛇毒NGF後AChE 活性恢復快於鹽水對照組，ACPase 也逐漸增高，眼鏡蛇毒NGF可能通過影響酶的活性而加快受損神經恢復。陳麗華等觀察舟山眼鏡蛇毒NGF對去部分背根貓脊髓背角內生長相關蛋白-43（GAP-43）表達的影響，發現眼鏡蛇毒NGF能有效誘導脊髓損傷修復過程中神經元GAP-43的合成而促進背根的側支出芽，出芽密度與眼鏡蛇毒NGF的治療劑量有關。

如何生產出活性穩定的成品，賦形劑的作用不可忽視。王立蘭等用舟山眼鏡蛇毒NGF為主要成分，對賦形劑配方進行了系統的研究，確定了一個不容易引起外來物過敏反應、對眼鏡蛇毒NGF活性保持比較好的配方，已用於眼鏡蛇毒NGF成品生產。

神經系統修復

眼鏡蛇毒NGF的發現，為人類神經系統損傷的修復帶來了曙光，也為許多的疑難雜症的醫治帶來了希望。根據小鼠領下腺神經生長因子臨床使用的有關資料證明，眼鏡蛇毒NGF的主要療效表現在以下凡個方面：（1）促進修復神經損傷。主要套用的臨床病症有：神經炎、原發性癲癰、神經衰弱、血管神經性頭痛、腦膜炎、腦外科手術後遺症、農藥中毒性腦病後遺症、腦中風后遺症、神經性耳聾、小兒麻痹症、腦萎縮、肌肉側索硬化症等疾病。（2）治療和緩解Alzheimer型老年痴呆症、老年舞蹈症、帕金森氏綜合症、格林巴利綜合症等老年退行性病症。（3）能有效的抑制某些腫瘤的有絲分裂，促使其向良性分化。如眼鏡蛇毒NGF對黑色素瘤、結腸癌等腫瘤有一定的療效。（4）促使皮膚組織的癒合，特別是對長期性潰爛具有較好的療效。（5）促使胚胎早期發育和調節抗體免疫功能。（6）具有防止學習和記憶功能缺陷的功能。