甲基化干擾試驗

甲基化干擾試驗

甲基化干擾實驗(Methylation interference assay)是根據DMS(硫酸二甲酯)能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤(G)殘基甲基化,而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割這一原理設計的另一種研究蛋白質同DNA相互作用的實驗方法。

基本介紹

  • 中文名甲基化干擾實驗
  • 外文名:Methylation interference assay
  • 研究方向:蛋白質同DNA相互作用
  • 缺點:DMS不能使T和C殘基甲基化
用途,實驗步驟,

用途

套用這種技術可以檢測靶DNA中G殘基的優先甲基化,對爾後的蛋白質結合作用究竟會有什麼效應,從而更加詳細的揭示出DNA與蛋白質相互作用的模式。

實驗步驟

用DMS處理靶DNA使之局部甲基化(平均每條DNA只發生一個G鹼基甲基化作用)
同細胞蛋白質提取物一起進行溫育,促進使DNA與蛋白質的結合
進行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶:
a、 其一沒有同蛋白質結合的DNA正常電泳條帶
b、其二同特異蛋白質結合而呈現滯後的DNA電泳條帶
將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出,並用六氫吡啶進行切割,結果為:
a、甲基化的G殘基被切割:因為轉錄因子蛋白質只能夠同未發生甲基化的正常的結合位點結合,所以在轉錄因子DNA結合位點序列中的G殘基如果被DMS甲基化之後,轉錄因子就無法同其結合位點(順式元件)發生結合作用,從而使得結合位點中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割;
b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會被切割
將結合蛋白質的DNA條帶和不結合蛋白質的DNA條帶,經六氫吡啶切割作用之後,再進行凝膠電泳
作放射自顯影,讀片並分析結果
3、結果判斷:
a、同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列,經六氫吡啶切割之後,電泳分離呈現兩條帶,有一個空白區
b、不同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列,經六氫吡啶切割後,電泳分離呈現三條帶,沒有空白區域的出現。
4、套用:
a、甲基化干擾實驗可以用來研究轉錄因子與DNA結合位點中的G殘基之間的聯繫;
b、是足跡實驗的一種有效的補充手段,可以鑑定足跡實驗中DNA與蛋白質相互作用的精確位置
5、缺點:
DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化,而不能使T和C殘基甲基化。

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