《甘蔗SPS D家族基因光暗磷酸化位點的調控機制研究》是依託福建師範大學，由張積森擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：甘蔗SPS D家族基因光暗磷酸化位點的調控機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：張積森
- 依託單位：福建師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因是植物糖份代謝的關鍵酶基因。甘蔗中，高豐度表達的SPS D2是單子葉植物特異的D家族基因，主要磷酸化位點僅保留受光調控的S-153，前期的研究確認了該位點明顯受光調控，由此推測反義突變該位點將抑制光調控磷酸化，明顯降低SPS D2的磷酸化水平，提高該酶活性。本項目擬用免疫雜交方法驗證所預測的甘蔗SPS D2 S-153位點的光暗調控磷酸化；進而對該位點進行反義突變，轉化到垂直同源基因被敲除的擬南芥中；分析突變和野生重組目的蛋白在相應磷酸激酶催化下的磷酸化水平；分析轉化植株的表型、碳水化合物含量、目的基因的分子水平、目的蛋白表達量及其S-153磷酸化水平、酶活性；以期在理論上探討單子葉SPS D家族光暗調控位點磷酸化調控機制，實踐套用上獲得改良的SPS D2基因用於高糖基因工程研究。
結題摘要
甘蔗是多年生的重要糖料作物。磷酸合成酶（SPS）是植物糖分代謝過程中一個不可逆的酶，其SPS活性受磷酸化共價修飾調控，並存在三個關鍵的磷酸話修飾位點，磷酸化修飾後能夠明顯降低該酶活性。單子葉中存在一個特有的SPSD家族，在該家族中也僅保留一個磷酸化位點——光暗磷酸化位點，但其磷酸化機制尚不清楚，推測定點突變該位點，能夠降低SPS磷酸化水平提高酶活性。由於甘蔗屬基因組巨大且是異源非整倍體，其基因組序列依然無法在短期內完成。本研究是基於比較基因組學和二代測序技術平台上，對甘蔗主要種間糖分代謝基因進化關係的比較和表達分析，通過定點突變SPS基因轉化擬南芥突變體，研究SPS的磷酸化機制，旨在為甘蔗高糖基因工程育種奠定最基礎性的分子生物學工作。主要進展如下： （1）通過與擬南芥、高粱、水稻等植物的比較基因組研究分析，對含有來自SPS家族基因的熱帶種及割手密種的14個BAC序列進行鑑定，並進一步進行基因組結構和功能注釋。結果發現在熱帶種和割手密種中均含有5個SPS基因，分別命名為SPSA、SPSB、SPSC、SPSD1、SPSD2.在熱帶種中五個成員的基因組大小為12,481 bp、5,595 bp、5,060 bp、9,313 bp、6,459 bp。對SPS的進化分析發現，SPSD家族基因為單子葉特異性基因，推測SPSA為SPSD家族基因祖先。這是首次對甘蔗的SPS基因家族進行系統的基因組學研究。 2、通過比較基因組研究分析結合基於RNA-seq的EST測序和實驗驗證，對甘蔗蔗糖磷酸合成酶進行片段化克隆，分析SPS單倍型和SNP。通過RNA-seq分析發現SPSB在蔗糖合成中發揮重要的作用，而SPSA在蔗糖積累中有重要作用，在脅迫處理條件下，SPSD2取代SPSB發揮蔗糖合成功能。 3、以高粱SPS cDNA序列為模板，採用Gateway 克隆技術，對甘蔗SPS家族基因全長cDNA進行同源克隆，瞬時轉染菸草，獲得其亞細胞定位為細胞膜。 4、對擬南芥轉基因進行不同光暗脅迫處理，對SPS酶活和植物體內碳水化合物進行測定，解析甘蔗SPS光暗磷酸化機制，Ser-153是SPSD2家族光暗磷酸化的重要調控位點。 5、通過項目實施，發表論文7篇和英文著作1章，其中SCI 2篇，中文核心4篇，1篇英文著作章節由Wil
