《狂犬病病毒基因與功能關係的研究》是依託華南農業大學，由郭霄峰擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：狂犬病病毒基因與功能關係的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：郭霄峰
- 依託單位：華南農業大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
狂犬病是一種高度致死的人獸共患病，對人類的生命安全構成了嚴重的威脅。本項目將運用病毒學、分子生物學、免疫學等方法和技術首先對狂犬病毒流行株進行分析，找出與當前動物用疫苗株的差異，對優勢毒株進行全毒株測序，分別克隆N、P、M、L、G基因。在已建立的狂犬病毒反向遺傳操作平台基礎上，構建以流行毒株為骨架的N、P、M輔助質粒。以Hep-flury全長感染性克隆為基礎，分別置換流行毒株的N、P、M、G、L基因，拯救含有流行毒株N、P、M、G、L基因的狂犬病毒，並對重組病毒進行致病性、免疫原性、細胞適應性、離心移行規律進行研究，定位病毒致病性、免疫原性、細胞適應性和離心移動的關健基因，篩選獲得免疫原性好、致病性低、細胞中穩定繁殖的狂犬病疫苗候選株，建立狂犬病毒流行株CZTT的反向遺傳作業系統。該項目的執行，對弄清我國狂犬病流行毒株的致病性、建立我國狂犬病的防控體系有著重要的科學意義和理論價值。
結題摘要
為了解析豬源狂犬病病毒（GD-SH01）的來源及與國內其它流行毒株的關係，我們對該病毒及全基因進行了分析。結果顯示， F1、F2和F3代病毒接種乳鼠後分別於14d、9d和7d出現典型的神經症狀。F4、F5代病毒接種乳鼠後5d也表現出神經症狀，第7d全部死亡。F5代病毒接種於6周齡昆明成鼠，能致鼠死亡。病毒接種於細胞，第四天病毒滴度達到最高（1.0×104FFU/mL）。將GD-SH01注射於6周齡和2周齡昆明系小鼠，第一天在2周齡昆明系小鼠腦內可檢測到GD-SH01的核酸，第二天在2周齡和6周齡小鼠腦內也可檢測到GD-SH01株的核酸。測序結果顯示，N、P、M、G、L基因核苷酸和胺基酸一致性與湖南、廣西的街毒相近。 為了系統地分析基因對狂犬病病毒功能的影響，我們拯救獲得了街毒單基因以及全基因替換的重組狂犬病病毒rHEP-shN、rHEP-shP、rHEP-shM、rHEP-shG、rHEP-shL和rGDSH,建立了街毒的反向遺傳技術平台。結果顯示, GD-SH01的N或L基因替換後， rHEP-shN、rHEP-shL的複製能力明顯強於親本HEP-Flury，而替換P基因則導致重組病毒複製能力降低。替換N、M、G、L基因的重組狂犬病病毒的致病力均強於HEP-Flury，而替換P基因的rHEP-shP毒力明顯減弱。全基因和G基因替換的rGDSH、rHEP-shG與親本野毒株GD-SH01一樣，可對成鼠致死。病毒擴散實驗表明,各重組病毒在BSR細胞上的擴散明顯比NA細胞慢。rHEP-shM、rHEP-shL的螢光斑點形成速度明顯大於HEP-Flury。對成鼠的免疫實驗表明，強毒P 基因對免疫後第一周抗體的產生至關重要。免疫後第二和第三周，雖然所有病毒誘導的抗體水平均超過3.0 EU/mL，但仍以rHEP-shP和rHEP-shN為最。研究還發現，街毒GD-SH01可誘發感染細胞的自噬，並且與M蛋白關係密切，但與病毒的繁殖無直接關係。 我們利用已建立的狂犬病病毒反向遺傳操作技術平台，拯救獲得了M基因分別重排至2和4位的重組病毒N1M2及N1M4。結果顯示，在BSR細胞2個重組病毒的複製能力比親本毒株弱。但是在SK細胞，三者之間多步生長曲線基本一致。擴散實驗顯示，在極低的MOI條件下，無論在BSR細胞上還是在SK細胞，兩株重組病毒的擴散能力都明顯弱於親本毒株。用螢光定量P
