溶藻弧菌NQR蛋白複合物耐藥的研究

《溶藻弧菌NQR蛋白複合物耐藥的研究》是依託中山大學，由李惠擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：溶藻弧菌NQR蛋白複合物耐藥的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李惠
• 依託單位：中山大學

中文摘要

我國為海水養殖大國，抗生素濫用嚴重，病原菌耐藥情況嚴峻。既往依靠發明新抗生素控制耐藥菌的策略越來越受到嚴峻挑戰，因為新抗生素髮現的周期較長且越來越難，而細菌對新抗生素的耐藥性很快出現。新抗生素的使用實際上是在選擇耐藥譜更寬的多重耐藥菌，使耐藥機制發生了變化，直接挑戰現今使用的新抗生素。因此，更新思路加強新耐藥機制的研究勢在必行。本項目基於前期發現耐藥溶藻弧菌Na+-NQR複合物下調以發揮耐藥作用的基礎上，結合提高提高質子動力勢(PMF)可以促進抗生素殺菌的相關報導，擬系統開展海水養殖重要病原性溶藻弧菌Na+-NQR蛋白複合物耐藥譜、蛋白質組、代謝組和分子特徵的研究。旨在揭示耐藥菌通過負調Na+-NQR複合物以調控其PMF，減少抗生素進入，實現耐藥的分子機制, 為控制海水養殖耐藥菌新藥研製提供高效靶點。

結題摘要

溶藻弧菌抗生素耐藥性對人和水產養殖是極大的威脅。該項目主要進行了3方面研究： 溶藻弧菌Na+-NQR複合物通過調控PMF耐受抗生素的作用機制:環境中NaCl濃度調節銅藻弧菌生理特徵已有報導，但是NaCl濃度是否調節細菌對抗生素抗性還不知道。該研究首先測定了溶藻弧菌在不同NaCl濃度中對抗生素抗性，結果發現隨著NaCl濃度升高，溶藻弧菌的抗生素抗性增加，尤其是氨基糖苷類抗生素增加最為顯著。接著，測定了溶藻弧菌胞內NaCl濃度和慶大黴素梯度，發現隨著NaCl濃度升高，進入到胞內的NaCl增多，慶大黴素含量卻降低。進一步採用基於GC–MS的代謝組學研究，發現丙酮酸循環的中間代謝物豐度在0.5%, 4% 和10% NaCl下表現出不同的表現。P循環中酶活性的不同和NQR複合物中亞基的不同表達使溶藻弧菌氧化狀態降低，導致NADH，PMF和ATP都下降。同時，氧化狀態降低致使NaCl負調PMF。這些結果致使NaCl濃度增加而胞內慶大黴素濃度下降。該研究揭示了以前未知的氧化狀態依賴的NaCl調節抗生素抗性機制。 PMF作用外的其他機制：NQR複合物作為鈉泵通過調節膜電位在氨基糖苷類抗生素抗性中起重要作用，是否還有其他機制不清楚。該研究首先構建了NQR複合物2個關鍵亞基基因nqrA 和 nqrF缺失菌株體，缺失後對氨基糖苷類抗生素、氯黴素類抗生素、頭孢類抗生素和多肽類抗生素抗性增加。然後採用基於GC-MS代謝組學對ΔnqrA和ΔnqrF代謝組研究，鑑定出下調的丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝為影響最大的代謝通路，降低的丙氨酸為最關鍵的分子標誌物。基因nqrA 和 nqrF缺失後，溶藻弧菌對慶大黴素的抗性增加，外源丙氨酸可逆轉該抗性。上述研究表明NQR複合物通過代謝調節抗生素抗性這個新的機制。 中心能量代謝下降是細菌耐藥重要特徵：採用iTRAQ分析了溶藻弧菌左氧氟沙星耐藥菌，得到了160個差異表達蛋白，其中70個表達下降，90個表達上升。通過iPath分析、qRT-PCR、膜電位和能荷比檢測，表明降低的中心碳代謝和能量代謝是溶藻弧菌左氧氟沙星耐藥性適應性的典型特徵。