《氧化還原摺疊酶模擬物的分子設計和作用機理研究》是依託天津大學，由董曉燕擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：氧化還原摺疊酶模擬物的分子設計和作用機理研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：董曉燕
- 依託單位：天津大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
模擬氧化還原摺疊酶的分子結構及其高效催化蛋白質分子內二硫鍵的形成、重排和肽鏈摺疊的作用機理，設計高效的小分子模擬物：利用分子動力學模擬研究氧化還原摺疊酶與底物的分子相互作用，同時基於氧化還原摺疊酶的分子結構，設計模擬物分子，研究其促進蛋白質氧化摺疊效果；建立多尺度分子動力學模擬方法，研究模擬物分子促進蛋白質摺疊動力學和分子相互作用；綜合實驗研究和分子動力學模擬解析，建立模擬物的理性設計方法；系統研究理性設計的模擬物促進蛋白質氧化摺疊過程，揭示分子機理；將摺疊酶模擬物的作用與其它抑制蛋白質聚集的復性方法相結合，建立高效蛋白質氧化復性方法。本項目將實驗研究、量子化學計算和多尺度分子動力學模擬有機結合，套用於複雜體系的分子相互作用分析和酶模擬物的分子設計，並在分子水平揭示氧化還原摺疊酶及其模擬物與底物的作用機理。研究成果對模擬酶分子設計理論的發展和蛋白質復性技術水平的提高具有重要意義。
結題摘要
蛋白質摺疊是重要的生命現象，也是使無活性的基因重組蛋白質產物（包含體）復性的關鍵。因此，蛋白質摺疊/復性是目前生命科學和生物技術領域的熱點研究課題。本課題首先研究了二硫鍵形成對蛋白質摺疊動力學的影響，發現溶菌酶的第一相摺疊速率和GSSG的濃度線性相關，表明混合二硫鍵的形成是速率決定步驟。在此基礎上，模仿氧化還原酶活性位點周圍具有疏水性區域的特點，開發出摺疊酶模擬小分子—醯基胱胺。通過對溶菌酶和核糖核酸酶A復性研究發現，醯基胱胺具有與DsbA類似的氧化特異性，體現出比胱胺更強的氧化能力，如己醯胱胺氧化劑的需求量僅為胱胺的一半。以此為基礎設計出更為有效的寡肽—RKCGC，由於所設計的RKCGC比胱胺具有更低的pKa和更高的還原勢，因此RKCGC與DTT耦合輔助蛋白質復性的效果更好。為了更加全面模擬氧化還原酶（PDI）整體結構，在RKCGC基礎上，進一步增加疏水區域，又設計了小分子摺疊酶模擬物RKCGCFF，由於疏水殘基的引入，提高了小分子摺疊酶模擬物的氧化特異性，從而增強了其氧化能力。能使0.07 mg/mL 溶菌酶，20min就可以達到70%的復性收率；而對照組在90 min只有50%的復性收率。此外RKCGCFF可通過疏水區域與底物結合，改變了變性蛋白的疏水性和表面電荷特性，使較高濃度的溶菌酶（0.7 mg/mL）得到了較好的復性效果（80%）。為了提高蛋白質氧化復性速率和收率，本研究建立了新型的氧化還原系統（4-巰基苯乙酸（ArSH）和己醯胱胺(HCA)），在最佳化後的條件下，可使0.3 mg/mLRNase A復性2 h收率可達92%，復性速率是傳統氧化還原體系的兩倍。最後，針對蛋白質在復性過程中易於聚集的問題，研究了同電荷介質對蛋白質復性的影響。結果表明，同電荷聚電解質可以作為復性添加劑來促進蛋白質復性。另外，微球表面的電荷密度是影響同電荷介質輔助蛋白復性效果的關鍵因素，高電荷密度的微球更有利於促進蛋白質復性。此外，微球粒徑越小，其輔助復性效果越好；微球的配基結構對其輔助復性的效果無影響；同電荷介質與尿素在抑制蛋白質聚集方面機制不同，二者具有協同作用。上述研究成果為進一步研製高效實用的蛋白質復性方法奠定了理論和實驗基礎。
