檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法

專利背景

禽流感是危害養禽業的重要傳染病，是由A型流感病毒引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合徵。截至2005年2月，根據血凝素（H）和神經氨酸酶（N），可將A型流感病毒分為不同亞型，已報導的有15種血凝素HA亞型（H1～H15）和9種神經氨酸酶NA亞型（N1～N9）。禽流感病毒呈世界分布，絕大多數禽流感病毒呈隱性感染，不表現任何臨床症狀，只有少數禽流感病毒具有迅速傳播和高致死性的特性，稱之為淚拘提笑高致病力禽流感病毒（HPAI）。高致病力禽流感通常是由H5和H7亞型禽流感病毒引起的，是嚴重危害養禽業的重大傳染病之一，世界動物衛生組織（OIE）將其列為A類傳染病，中國也將其列為一類檢疫對象。1994年，墨西哥在其中部地區發病的商品雞群中分離出H5N2禽流感病毒；1995年，美國猶他州發生由H7N3引起的禽流感，在方圓800公里的暴發地區內，比較集中的火雞群相互之間都受到了感染；1997年香港的養雞場和禽類市場爆發了由H5N1引起的禽流感，並導致人的嚴重疾病，在全世界引起極大恐慌；1999年，義大利發生了由H7N1引起的禽流感，火雞的死亡率很高；2001年，香港再度受到禽流感病毒H5N1的困擾。自韓國2001年從上海出口的鴨肉中檢測幾驗白出禽流感病毒H5亞型後，日本、歐盟等對中國出口禽肉採取嚴厲檢疫措施，日本聲稱從中國出口的禽肉中多次檢出高致病力禽流感病毒H9亞型，2003年4月，在中國受“非典”影響出口滑坡的情況下，日本從中國出口鴨肉中三次檢出禽流感病毒H5亞型，導致封關。在中國國內疫情複雜、中國國外頻頻對中國出口禽肉檢出問題的嚴峻形勢下，如果不採取嚴格的檢驗檢疫措施，勢必影響禽肉的出口。

禽流感主要依靠實驗室進行確切診斷，診斷方法主包括血清學檢測及病原的分離和鑑定兩方面。血清學檢測的對象是從禽類體內採集血液析出血清後，檢測血清中抗體的有無和滴度變化。病原學檢測方法的對象是病毒，因為病毒通常在呼吸道和（或）腸道複製，所以一般從活禽或死禽的器官和（或）泄殖腔能分離到病毒，常用棉拭子從活禽氣管或泄殖腔取樣來分離病毒，也可以直接採集病料組織，棉拭子或病料均可以放入滅菌的保存液，然後送往專門的流感診斷實驗室進行診斷。

國家質檢總局在2001年下發檔案，要求對禽肉出口企業進行每兩個月一次的定期監測，該規定要求用雞胚病毒分離方煮辯辨法。雞胚病毒分離是一種敏感、特異的方法，但是耗時長，約需3周左右，操作煩瑣，只能起到監測作用，不能作快速檢測用，不利於快速通關和控制禽肉攜帶病毒。

發明內容

專利目的

《檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法》的第一個目的是提供一組特異性整享試強、靈敏度高的用於檢測各型禽流感病毒的核苷酸序列。

該發明的第二個目的是提供一組特異性強、靈敏度高的用於檢測H5亞型禽流感病毒的核苷酸序列。

該發明的第三個目的是提供一種操作簡單、結果準確的用與檢測禽流感病毒的試劑盒。

該發明的第四個目的是提供一種快捷、準確、方便的檢測禽流感病毒的方法。

技術方案

禽流感病毒通用引物、探針序列：

上游引物：CGTCAGGCCCCCTCAAA

下游引物：AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA

探針：FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA

作為探針的核苷酸序列在5’端和3’端分別連線螢光報告基團（FAM）和螢光淬滅基團（TAMRA），委託美國Integrated DNA Technologies，inc合成。

選擇A型禽流感病毒的共有NP基因序列設計多對通用引物和探針，引物長度一般為20個鹼基左右，GC含量為50％-60％，引物內無二級結構和重複性，引物間和引物內無互補序列，引物間的熔解溫度（Tm值）相差小於5℃。探針的長度在25個鹼基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右櫻灑抹夜。進行大量篩選試驗得到以上序列，該通用引物和探針序列不僅能夠用來檢測禽流感病毒H5、H7、H9亞型，而且對其他禽流感章永病毒亞型也能檢出，用其檢測常見其他禽類病毒，未發現交叉反應。該通用引物可以在短時間內檢測出樣本是否感染了禽流感病毒，節約人力和物力和檢測時間。

禽流感病毒H5亞型引物、熱戀台探針序列：

上游引物：CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGG

下游引物：ATAAGCCATACCACATTTCTGAAAAAGG

探針：FAM-CCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCC-TAMRA

由於H5亞型的禽流感病毒具有高致病性，且可傳染給人類，危害極大，因此在檢測到樣本被禽流感病毒感染後需要進一步確認感染的病毒是否為H5亞型，做到及早發現，及早處理，防止禽流感蔓延。

一種檢測禽流感病毒的試劑盒，以上述禽流感病毒通用引物和探針或者禽流感病毒H5亞型特異引物和探針，其組成如下：

一、樣本處理試劑：

裂解液：自INVITROGEN公司購買，貨號10296

二、核酸擴增試劑：

1、RT-PCR反應液，見下表：

組分終濃度10×PCR緩衝液1×PCR緩衝液TaqE1u

表1

組分	終濃度
10×PCR緩衝液	1×PCR緩衝液
TaqE	1u
引物I	0.2微摩爾/升
引物II	0.2微摩爾/升
探針	0.1微摩爾/升

2、RT-PCR酶：0.25顆/test，購自安發瑪西亞公司公司購買，貨號27-9259-01。

3、Taq酶：5U/微升，自上海普洛麥格公司購買。

4、DEPC水：自來水兩次蒸餾，經過MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，電阻率≥18.0兆歐·厘米。

三、對照品

1、陰性對照：滅活的陰性尿囊液（委託專業的SPF雞場孵育SPF雞胚至12日齡，無菌抽取雞胚尿囊液；60℃作用1小時滅活）

2、陽性對照：體外轉錄的RNA

一種檢測禽流感病毒的方法，使用禽流感病毒通用引物和探針或者禽流感病毒H5亞型特異引物和探針，滅活尿囊液為陰性對照，對樣本進行RT-PCR反應，並判斷結果，其中：

（一）RT-PCR反應的循環條件為：42℃：30分鐘；92℃：3分鐘；92℃：10秒，45℃：30秒72℃：1分鐘5個循環；92℃：10秒，60℃：30秒40個循環，60℃時設定收集螢光；

（二）結果判定標準：

（1）陰性對照的檢測結果為陰性；陽性對照的Ct值應小於等於28.0；否則，此次實驗視為無效；

（2）Ct值無數值的樣本為陰性樣本；Ct值≤30.0的樣本為陽性；

（3）Ct值大於30.0的樣本建議重做：重做結果無數值者為陰性，否則為陽性。

有益效果

1）快速：從樣品處理到出結果僅需4小時左右；

2）敏感：檢測組織臟器和拭子的靈敏度與雞胚病毒分離基本一致；

3）特異：與常見禽類其他病毒不發生交叉反應，而且不僅採用了特異性的引物，還採用了特異性的探針，使該方法的特異性高於傳統PCR方法，杜絕了非特異性擴增造成的假陰性結果；

4）靈敏：由於採用了特異性的螢光探針和高靈敏度的螢光PCR儀，使該方法比傳統的PCR方法靈敏度高100～1000倍。對於禽流感病毒尿囊液，稀釋至10仍可檢出，接近雞胚病毒分離；

5）操作簡單：試劑盒給檢測者提供了質量優異的試劑及最佳化的操作程式，經過簡單的培訓，檢測者就可勝任該項工作。

技術領域

《檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法》涉及檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法，尤指一組用以檢測各亞型的禽流感病毒的特異性核苷酸序列、含有這些序列的試劑盒、以及用該組序列與試劑盒檢測禽流感病毒的方法，屬於檢驗檢疫領域。

權利要求

1.一組用於檢測各型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1-No.3所示的鹼基序列。

2.根據權利要求1所述的一組用於檢測各型禽流感病毒的核苷酸序列，其特徵在於：所述序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列在5’端和3’端分別連線螢光報告基團FAM和螢光淬滅基團TAMRA。

3.一組用於檢測H5亞型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.4-SEQ ID No.6所示的鹼基序列。

4.根據權利要求2所述的一組用於檢測H5亞型禽流感病毒的核苷酸序列，其特徵在於：所述序列表SEQ ID No.6的核苷酸序列在5’端和3’端分別連線螢光報告基團FAM和螢光淬滅基團TAMRA。

5.一種檢測禽流感病毒的試劑盒，其特徵在於：採用權利要求1-4所述的核苷酸序列作為檢測禽流感病毒的引物I、引物II或探針序列。

6.根據權利要求5所述的一種檢測禽流感病毒的試劑盒，其特徵在於：其組成如下：

1）裂解液；

2）RT-PCR反應液，終濃度配製成：10×PCR緩衝液；1uTaqE；0.2微摩爾/升引物I；0.2微摩爾/升引物II；0.1微摩爾/升探針；0.1微摩爾/升DNTP；

3）RT-PCR酶：0.25顆/test；

4）Taq酶5U/微升；

5）DEPC水；

6）陰性對照：滅活陰性尿囊液；

7）陽性對照體：外轉錄的RNA。

實施方式

實施例1.篩選通用引物和探針序列

一.材料：涉及的毒種由北京出入境檢驗檢疫局分離保存

二.方法

（一）設計合成引物和探針序列

A型流感病毒的基因組由8個單獨的單鏈RNA片段組成，該試劑盒選擇禽流感病毒RNA作為靶區域。選擇A型禽流感病毒的共有NP基因序列設計多對通用引物和探針，引物長度一般為20個鹼基左右，GC含量為50％-60％，引物內無二級結構和重複性，引物間和引物內無互補序列，引物間的熔解溫度（Tm值）相差小於5℃。探針的長度在25個鹼基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

引物和探針從不同廠家合成，如上海生工、大連寶生物、中國國外公司如GIBCO/BRL、IDT等等，要求PAGE純或HPLC純，到貨時同時提供廠家對該產品的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜。收到引物後做HPLC分析，應該得到單吸收峰圖譜、用紫外分光光度計測定OD260納米/OD280納米的比值在1.6-2.0之間，則視為合格引物。

（二）篩選和配對

1.通過引物、探針的篩選實驗將上述上游引物和下游引物結合探針位置進行配對，PCR反應體系如表2所示：

表2：PCR反應體系

組分	終濃度
RT-PCRbeads	0.25粒
TaqE	1u
引物I	0.2微摩爾/升
引物II	0.2微摩爾/升
探針	0.1微摩爾/升
棋板RNA	10微升
補DEPC水至	25微升

RT-PCR beads為Amersham Pharmacia Biotech Inc的Ready-To-GoTM RT-PCR Beads（Cat.No.27-9259-01）。

2.PCR循環參數如：42℃：30分鐘；92℃：3分鐘；92℃：10秒，45℃：30秒72℃：1分鐘5個循環；92℃：10秒，60℃：30秒40個循環，60℃時設定收集螢光；

3.採用上述條件對禽流感病毒的毒株尿囊液10倍稀釋提取RNA，選取合適的引物搭配進行擴增，同時對陽性模板10、10、10、10、10進行擴增，得到效率和升幅較高的引物及與之配對的探針序列。

三.結果

上游引物：CGTCAGGCCCCCTCAAA

下游引物：AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA

探針：FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA

探針的5’端和3’端分別連線螢光報告基團（FAM）和螢光淬滅基團（TAMRA），委託美國Integrated DNA Technologies，inc合成。該組通用引物和探針序列可用於檢測各型禽流感病毒。

四.陽性對照品的製備：

1.擴增目的核酸片段

按表1配方配成RT-PCR反應液，加入陽性H5-1RNA模板，用PE2400擴增儀進行PCR擴增，擴增條件見表2，以期得到大量的目的片段。PCR完畢，用1.8％瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測擴增產物，紫外燈下見到一條分子量大小正確的特異性亮帶、無非特異性擴增帶，則證明擴增成功，保留PCR產物備用。

RT-PCR酶：安發瑪西亞公司的Ready-To-GoTMRT-PCRBeads（Cat.No.27-9259-01）

RT-PCR反應循環參數：42℃：30分鐘；94℃：5分鐘；95℃：5秒，55℃：30秒，72℃：60秒，40個循環

2.純化目的核酸片段

採用Promega公司的Wizard PCR Preps DNA Purification System（Cat#A7170、Lot#11356102）試劑盒純化上述PCR產物中的目的核酸片段。再用1.8％瓊脂糖凝膠電泳的方法對純化的擴增產物進行粗略定量。

3.連線反應

用Promega公司的PGEM-TEasy Vertor SystemII（Cat#A1380、Lot#86893）試劑盒將目的片段與T載體相連線。

表3：連線反應體系

組分	體積
2×buffer	5微升
T-vector	1微升
PCR product	X微升
T4 DNA Ligase	1微升
補加去離子水至	10微升

連線反應中將PCR產物與T載體的數量的比值控制在1∶3-3∶1之間，因為此時連線效率最高。連線反應的條件為：4℃過夜，如不立即進行後續步驟，連線產物保存在4℃。

4.轉化

按照Promega公司的PGEM-T Easy Vertor System II的說明書要求，將上述連線產物轉化入JM109感受態細胞，然後將轉化的感受態細胞塗於含有X-Gal和IPTG的瓊脂平板，37℃培養12-16小時。

5.克隆菌落鑑定

從平板上長出的藍色、白色菌落中隨機挑取3-4個白色菌落，提取質粒，用PCR反應液檢測，擴增陽性的為合格的克隆菌落。

6.質粒擴增

挑取經鑑定為陽性的菌落，用3-5毫升液體LB培養基培養，37℃搖床振盪培養12-16小時。

7.質粒純化

用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Cat#A7100、Lot#10454011）試劑盒進行質粒的提純，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳的方法對提純的質粒進行純度檢測。

8.體外轉錄

以純化的質粒為模板，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7（Cat#P1300、Lot#125575）試劑盒進行體外轉錄；將體外轉錄產物用DNase除去其中的DNA模板後，即得到製備AIV陽性對照品所需的RNA陽性對照品母液。

體外轉錄體系見表4。反應條件為37℃溫浴2-4小時。

表4：T7體外轉錄體系

組分	終濃度
5×buffer	20微升
dNTPs（25mMATP，CTP，GTP，TTP）	30微升
Linear DNA template（5-10ugtotal）	X微升
Enzyme Mix（T7）	10微升
補加Nuclease-Free水至	100微升

9.陽性對照品的檢驗

（1）陽性對照品母液的檢驗

用紫外分光光度計測定OD260納米/OD280納米的比值應在1.8-2.0之間，用合格的試劑進行檢定應為陽性。

（2）陽性對照品的檢驗

將陽性對照品母液用1×TE進行10倍梯度稀釋，得到多個梯度稀釋液。各個梯度稀釋液用合格禽流感病毒螢光RT-PCR檢測試劑盒（適用於H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亞型）進行Ct值標定，取Ct值在22.0～28.0之間的稀釋液作為試劑盒的陽性對照，分裝後-70℃保存。

實施例2.篩選禽流感病毒H5亞型引物和探針序列

一.材料：涉及的毒種由北京出入境檢驗檢疫局分離保存，如下：

禽流感病毒H5-1株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5-2株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5-3株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5-4株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5-5株：禽流感病毒H5亞型

二.方法

（一）設計合成引物和探針序列

禽流感病毒H5亞型（AIVH5）的基因組由8個單獨的單鏈RNA片段組成，選擇HA基因作為靶區域。分兩個區域選擇其中缺乏二級結構且保守的基因區設計多對引物和探針。引物長度一般為20個鹼基左右，GC含量為50％-60％，引物內無二級結構和重複性，引物間和引物內無互補序列，引物間的熔解溫度（Tm值）相差小於5℃。探針的長度在25個鹼基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

引物和探針從不同廠家合成，如上海生工、大連寶生物、中國國外公司如GIBCO/BRL、IDT等等，要求PAGE純或HPLC純，到貨時同時提供廠家對該產品的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜。收到引物後做HPLC分析，應該得到單吸收峰圖譜、用紫外分光光度計測定OD260納米/OD280納米的比值在1.6-2.0之間，則視為合格引物。

（二）篩選和配對

1.通過引物、探針的篩選實驗將上述上游引物和下游引物結合探針位置進行配對，PCR反應體系同表2。

2.PCR循環參數如下：

42℃：30分鐘；92℃：3分鐘；

92℃：10秒，45℃：30秒72℃：1分鐘5個循環

92℃：10秒，60℃：30秒40個循環，60℃時設定收集螢光；

3.採用上述條件對禽流感病毒的毒株尿囊液10倍稀釋提取RNA，選取合適的引物搭配進行擴增，同時對陽性模板（用禽流感病毒H5-1株尿囊液，PBS稀釋10至10，採用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA備用）10、10、10、10、10進行擴增，得到效率和升幅較高的引物及與之配對的探針序列。

三.結果

上游引物：CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGG

下游引物：ATAAGCCATACCACATTTCTGAAAAAGG

探針：FAM-CCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCC-TAMRA

探針的5’端和3’端分別連線螢光報告基團（FAM）和螢光淬滅基團（TAMRA），委託美國Integrated DNA Technologies，inc合成。該組引物和探針序列用於特異性地檢測H5亞型禽流感病毒。

實施例3.禽流感病毒通用螢光RT-PCR檢測試劑盒

一.螢光RT-PCR反應體系的最佳化

（一）方法：將實施例1最終得到的引物濃度從0.1微摩爾/升至0.8微摩爾/升以0.1微摩爾/升遞增，探針濃度從0.025微摩爾/升至0.2微摩爾/升以0.025微摩爾/升遞增。對引物和探針不同濃度的配比進行了比較，其他條件均同表2。

採用上述配比對毒株BJCIQ-H9（北京出入境檢驗檢疫局保存）尿囊液10稀釋所提取的核酸進行擴增，循環條件同表3，每組均採用復管進行實驗。

（二）結果：從多次重複實驗中發現，不同濃度的引物、探針對於該陽性模板，CT值基本穩定在27.6-28.2，但引物濃度為0.2微摩爾/升，探針濃度為0.1微摩爾/升時螢光增幅較高，所以選定引物濃度為0.2微摩爾/升，探針濃度為0.1微摩爾/升作為禽流感病毒螢光RT-PCR檢測試劑盒（適用於H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亞型）引物和探針濃度。

二.試劑盒的組成

（一）樣本處理試劑：裂解液（購自INVITROGEN公司，貨號10296）

（二）核酸擴增試劑：

1.RT-PCR反應液：同表1。

2.RT-PCR酶：含量12顆，0.25顆/test（購自安發瑪西亞公司公司，貨號27-9259-01）

3.Taq酶：5U/微升（購自上海普洛麥格公司）

4.DEPC水：自來水兩次蒸餾，經過MilliporeMILLI-QPFPLUS純水儀純化，電阻率≥18.0兆歐·厘米。

（三）對照品

1.陰性對照：滅活尿囊液

2.陽性對照：體外轉錄的RNA（用禽流感病毒H5-1株尿囊液，PBS稀釋10至10，採用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA備用。）

RT-PCR反應液中的引物I、引物II和探針序列為禽流感病毒通用引物、探針序列：

上游引物：CGTCAGGCCCCCTCAAA

下游引物：AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA

探針：FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA

該試劑盒適用於檢測A型禽流感病毒H1、H2、H3、H5、H7、H9和H13亞型。

實施例4.禽流感病毒H5亞型螢光RT-PCR檢測試劑盒

RT-PCR反應液中的引物I、引物II和探針序列為禽流感病毒H5亞型特異引物、探針序列：

上游引物：CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGG

下游引物：ATAAGCCATACCACATTTCTGAAAAAGG

探針：FAM-CCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCC-TAMRA

陽性對照：體外轉錄的RNA（用禽流感病毒H5-N1尿囊液，PBS稀釋10至10，採用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA備用。）

其餘同實施例3。該試劑盒用於檢測禽流感病毒H5亞型。

實施例5.檢測禽流感病毒的方法

一.樣本採集、存放及運輸

（一）樣本採集：所用取樣器材必須經高壓或乾熱滅菌。

若樣品為活禽，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子時將拭子深入喉頭口及上顎裂來回刮幾次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子時將拭子深入瀉殖腔轉一圈沾取糞便。然後將拭子一起放入盛有2毫升PBS（含抗菌素）的試管，充分洗滌拭子，然後在管壁擠乾液體，轉入無菌離心管中備用。

若樣品為新鮮肌肉或臟器，取待檢樣品2g於已洗淨、滅菌並烘乾的研缽中充分研磨，加10毫升PBS混勻，取上清轉入無菌離心管中備用。為使樣品的代表性更強，也可取50克肉樣，加入50毫升無菌的PBS液，用Bagmixer均質器處理後，取上清備用。

若樣品為血清、血漿或冷凍組織滲出液，則直接取用。

（二）存放：分離後的樣本在2℃-8℃條件下保存應不超過24hr；-70℃以下可長期保存，但應避免反覆凍融。

（三）運輸：採用冰壺或泡沫箱加冰密封進行運輸。

二.樣本處理

（一）取n個1.5毫升滅菌離心管（n＝樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照），作好標記。

（二）首先加入600微升裂解液，然後分別加入待測樣本、陰性對照、陽性對照各200微升；再加入200微升氯仿，混勻器上振盪混勻5秒。

（三）於12,000轉/分鐘離心15分鐘（如有條件，於4℃進行離心）。

（四）取與步驟（一）中相同數量的1.5毫升滅菌離心管，加入400微升異丙醇（-20℃預冷），作好標記。

（五）吸取步驟（三）各管中的上清液相轉移至相應的管中（上清液應至少吸取500微升，注意不要吸出中間層），顛倒混勻。

（六）12,000轉/分鐘離心15分鐘。輕輕倒去上清，倒置於吸水紙上，沾乾液體；加入600微升75％乙醇（-20℃預冷），顛倒洗滌。

（七）12,000轉/分鐘離心10分鐘。輕輕倒去上清，倒置於吸水紙上，儘量沾乾液體。

（八）4,000轉/分鐘離心10秒，將管壁上的殘餘液體甩到管底部，用微量加樣器儘量將其吸乾，室溫乾燥3分鐘。

（九）每管加入11微升DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2,000轉/分鐘離心5秒，冰上保存備用。

三.RT-PCR擴增

（一）擴增試劑準備：從試劑盒中取出RT-PCR反應液、Taq酶，在室溫下融化後，2,000轉/分鐘離心5秒。設所需PCR管數為n（n＝樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應體系配製如下表：

表5

試劑	RT-PCR反應液	Taq酶
用量	15微升	0.25微升

計算好各試劑的使用量，加入一適當體積試管中，向其中加入n/4顆RT-PCR酶顆粒，充分混合均勻，向每個PCR管中各分裝15微升。

（二）加樣

在各設定的PCR管中分別加入上述樣本處理步驟中製備的RNA溶液各10微升，蓋緊管蓋，於400轉/分鐘離心5秒。將PCR管排好放入螢光PCR檢測儀內，記錄樣本擺放順序。

（三）RT-PCR反應

循環條件設定：42℃：30分鐘；92℃：3分鐘；92℃：10秒，45℃：30秒72℃：1分鐘5個循環；92℃：10秒，60℃：30秒40個循環，60℃時設定收集螢光。

四.結果判定

（一）結果分析條件設定：讀取檢測結果，閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準。或可根據儀器噪音情況進行調整。

（二）結果判定：

1.質控標準：陰性對照的檢測結果為陰性。

陽性對照的Ct值應小於等於28.0。否則，此次實驗視為無效。

2.結果判斷：Ct值無數值的樣本為陰性樣本。Ct值≤30.0的樣本為陽性。

Ct值大於30.0的樣本建議重做。重做結果無數值者為陰性，否則為陽性。

實施例6.禽流感病毒通用引物和探針的特異性和靈敏性試驗

將建立的檢測禽流感病毒的螢光RT-PCR方法檢測不同稀釋度的雞胚感染尿囊液，並與雞胚分離方法比較，評估該方法的靈敏度；檢測不同亞型的禽流感病毒標準抗原，評估該方法的敏感性；用該方法檢測常見禽類病毒，以評估該方法的特異性。

一.材料與方法

（一）材料

1.病毒株：由北京出入境檢驗檢疫局分離保存，所有毒種均經相應部門鑑定：

禽流感病毒H5N1-AC1株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5N1-AC2株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5N1-AC3株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5N1-AD1株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5N1-AD2株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5N1-AD3株：禽流感病毒H5亞型

BJCIQ-H7-BJV1：禽流感病毒H7亞型

BJCIQ-H7-BJV2：禽流感病毒H7亞型

BJCIQ-H7-GDV1：禽流感病毒H7亞型

BJCIQ-H7-SDV1：禽流感病毒H7亞型

BJCIQ-H9：三株禽流感病毒H9亞型

新城疫F48E9、新城疫I系苗、新城疫II系苗、新城疫IV系苗、IBDV、IBV疫苗（H120、H52）、KIBV、CAAV、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒。（來源於北京出入境檢驗檢疫局動檢實驗室）

2.SPF雞胚：購自北京實驗動物中心。

3.禽流感病毒螢光RT-PCR檢測試劑盒（實施例2）

（二）方法

1.靈敏度試驗：

將10株禽流感病毒（6株禽流感病毒H5亞型、2株禽流感病毒H7亞型、2株禽流感病毒H9亞型）的感染尿囊液作10、10、10、10、10、10、10、10、10、10倍稀釋，分成兩份，一份做螢光RT-PCR，一份接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚，每天觀察兩次。

2.對不同亞型的禽流感病毒檢測：

用建立的禽流感病毒螢光RT-PCR檢測試劑盒（適用於H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亞型）檢測禽流感病毒標準抗原H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13（H1、H2、H3、H13來源於中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，H5、H7、H9來源於北京出入境檢驗檢疫局動檢實驗室），以驗證該方法是否對所有禽流感病毒均可檢測。

3.特異性試驗：

用禽流感病毒螢光RT-PCR檢測試劑盒檢測收集到的常見禽類病毒：新城疫F48E9、新城疫I系苗、新城疫II系苗、新城疫IV系苗、IBDV、IBV疫苗（H120、H52）、KIBV、CAAV、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒。觀察是否出現假陽性反應。

二.結果和討論

1.檢測10株禽流感病毒感染尿囊液的敏感性以及與雞胚病毒分離比較見下表：

表6：禽流感病毒螢光RT-PCR檢測試劑盒的靈敏度

病毒株	試劑盒測極限	雞胚最小致死量
H5N1-AC1	10	10
H5N1-AC2	10	10
H5N1-AC3	10-	10
H5N1-AD1	10	10
H5N1-AD2	10-	10
H5N1-AD3	10	10
H7-BJV1	10	10
H7-BJV2	10	10
H9N2	10	10
H9N2	IO*	10

從表6中可以看出，在檢測禽流感病毒感染雞胚尿囊液時，雞胚病毒分離較螢光RT-PCR敏感。螢光RT-PCR檢測雞胚感染尿囊液的最高稀釋度為10，最低為10。

2.檢測禽流感病毒標準抗原H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13，結果對於所有抗原該試劑盒均可檢出陽性，Ct值基本一致。由此可見：該試劑盒能夠檢測到可以購買到的禽流感病毒所有的亞型，說明禽流感病毒螢光RT-PCR檢測試劑盒的探針、引物具有通用性。

3.檢測常見禽類病毒結果，見下表：

表7：禽流感病毒螢光RT-PCR檢測試劑盒的特異性

病毒株	螢光RT-PCR檢測結果
新城疫F48E9	-
新城疫I系苗	-
新城疫II系苗	-
新城疫IV系苗	-
IBDV	-
IBV疫苗（H120）	-
IBV（H52）	-
KIBV	-
CAAV	-
鴨瘟病毒	-
鴨肝炎病毒	-

從表7中可以看出，建立的禽流感病毒螢光RT-PCR檢測試劑盒（適用於H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亞型）檢測禽流感病毒方法與常見的禽類病毒無交叉反應，說明設計的引物、探針特異性良好。

實施例7.禽流感病毒H5亞型螢光RT-PCR方法的靈敏度、敏感性和特異性實驗

將建立的檢測禽流感病毒H5亞型的螢光RT-PCR方法檢測不同稀釋度的雞胚感染尿囊液，並與雞胚分離方法比較，評估該方法的靈敏度；用該方法檢測其餘禽類病毒，以評估該方法的特異性。

一.材料與方法

1.材料

病毒株：該試驗涉及的毒種由北京出入境檢驗檢疫局分離保存，具體如下：

禽流感病毒H5-1株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5-2株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5-3株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5-4株：禽流感病毒H5亞型

禽流感病毒H5-5株：禽流感病毒H5亞型

所有毒種均經相應部門鑑定。

SPF雞胚：購自北京實驗動物中心。

2.方法：

（1）禽流感H5亞型螢光RT-PCR檢測方法的靈敏度實驗：

將5株禽流感病毒H5亞型的感染尿囊液作10、10、10、10、10、10、10、10、10、10倍稀釋，分成兩份，一份做螢光RT-PCR，一份接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚，每天觀察兩次。

（2）禽流感病毒H5亞型螢光RT-PCR檢測方法對不同亞型的禽流感病毒檢測：

用建立的禽流感病毒H5亞型螢光RT-PCR檢測方法檢測禽流感病毒標準抗原Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，以驗證該方法是否對所有禽流感病毒H5亞型均可檢測。

（3）禽流感病毒H5亞型螢光RT-PCR檢測方法的特異性

用禽流感病毒H5亞型螢光RT-PCR檢測方法檢測收集到的常見禽類病毒：禽流感H7亞型、禽流感H9亞型、新城疫F48E9、新城疫I系苗、新城疫II系苗、新城疫IV系苗、IBDV、IBV疫苗（H120、H52）、KIBV、CAAV、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒。觀察是否出現假陽性反應。

二.結果

1.禽流感病毒H5亞型螢光RT-PCR檢測5株禽流感病毒H5亞型感染尿囊液的敏感性以及與雞胚病毒分離比較見表8：

表8：H5亞型螢光RT-PCR檢測方法的靈敏度

病毒株	H5亞型螢光RT-PCR檢測極限	雞胚最小致死量
H5N1-1	10	10
H5N1-2	10	10
H5N1-3	10	10
H5N1-4	10-	10
H5N1-5	10	10

從表8中可以看出，在檢測禽流感病毒H5亞型感染雞胚尿囊液時，雞胚病毒分離較螢光RT-PCR敏感。螢光RT-PCR檢測雞胚感染尿囊液的最高稀釋度為10，最低為10。

2.禽流感病毒H5亞型螢光RT-PCR檢測常見禽類病毒結果，見表9：

病毒株螢光RT-PCR檢測結果禽流感H7亞型-禽流感H9亞型-新城疫F48E9-新城疫I系苗-

新城疫II系苗-新城疫IV系苗-IBDV-IBV疫苗（H120）-IBV（H52）-KIBV-CAAV-鴨瘟病毒-鴨肝炎病毒-

表9：禽流感病毒H5亞型螢光RT-PCR的特異性

病毒株	螢光RT-PCR檢測結果
禽流感H7亞型	-
禽流感H9亞型	-
新城疫F48E9	-
新城疫I系苗	-
新城疫II系苗	-
新城疫IV系苗	-
IBDV	-
IBV疫苗（H120）	-
IBV（H52）	-
KIBV	-
CAAV	-
鴨瘟病毒	-
鴨肝炎病毒	-

從表9中可以看出，建立的H5亞型螢光RT-PCR檢測禽流感病毒方法與常見的禽類病毒無交叉反應，說明設計的引物、探針特異性良好。

榮譽表彰

2014年11月6日，《檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。

檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法

基本介紹

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發明內容

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有益效果

技術領域

權利要求

實施方式

榮譽表彰

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