核糖體展示技術:概述,原理,操作步驟,基因片段的改造,體外轉錄和翻譯,親和篩選,體

核糖體展示技術(Ribosome Display Technology, RDT)是由Plückthun 實驗室在多聚核糖體展示技術的基礎上改進而來的一種利用功能性蛋白相互作用進行篩選的新技術，它將正確摺疊的蛋白及其 mRNA同時結合在核糖體上，形成mRNA-核糖體-蛋白質三聚體，使目的蛋白的基因型和表型聯繫起來，可用於抗體及蛋白質文庫選擇、蛋白質體外改造等。運用此技術已成功篩選到一些與靶分子特異結合的高親和力蛋白質，包括抗體、多肽、酶等，是蛋白質篩選的重要工具。

基本介紹

中文名：核糖體展示技術
外文名：Ribosome display technology
利用：功能性蛋白相互作用進
用於：抗體及蛋白質文庫選擇

概述,原理,操作步驟,基因片段的改造,體外轉錄和翻譯,親和篩選,體外分子定向進化,優勢,問題,前景,

概述

原理

核糖體展示技術通過聚合酶鏈反應（PCR）擴增DNA文庫，同時引入T7 啟動子、核糖體結合位點及莖-環結構，將其轉錄成 mRNA，在無細胞翻譯系統中進行翻譯，使目的基因的翻譯產物展示在核糖體表面，形成 “mRNA-核糖體-蛋白質” 複合物，構成核糖體展示的蛋白文庫，然後用相應的抗原從翻譯混合物中進行篩選，以乙二胺四乙酸（EDTA）解離結合的核糖體複合物或以特異抗原洗脫整個複合物，並從中分離mRNA。通過反轉錄聚合酶鏈反應（RT- PCR）提供下一輪展示的模板，所得 DNA進入下一輪富集，部分 DNA可通過克隆進行測序分析等。

Kawasaki 曾建議採用類似的途徑從肽庫中篩選多肽配體。在此之前，利用前期多肽抗體進行免疫沉澱，已經分離到了與核糖體和多肽偶聯的mRNA。 Mattheakis等人首次將前人的構想付諸實踐，建立了篩選多肽類配體的多聚核糖體展示技術，並從一個庫容為10^12的肽庫中，篩選到親和力常數達到10^9 (nmol級) 的固定化單抗的多肽配體。 Gersuk等人利用該技術也篩選到前列腺癌腫瘤標記的多肽配體。體外翻譯時，蛋白或多肽的摺疊與翻譯同步進行u。與核糖體結合的天然多肽也具有酶活性。這些研究結果說明，如果某種蛋白質的摺疊不受核糖體蛋白通道的影響，那么與核糖體的解離就不是該蛋白獲得天然構像的必要條件。1 9 9 7 年，Plückthun實驗室在以上研究成果的基礎上，對 M a t t h e a k i s的多聚核糖體展示技術進行了改進，建立了體外篩選完整功能蛋白( 如抗體 ) 的新技術：核糖體展示技術。

操作步驟

基因片段的改造

為了使基因片段能有效轉錄和翻譯,5′端應接上T7啟動子序列和SD序列，去掉3′端的終止密碼子,從而成功地使核糖體停留在mRNA3′末端,將蛋白質和mRNA連線在一起。在對基因片段改造時,常進行多次延伸PCR：

①分別將需要的基因片段和間隔序列各自擴出來

② 用引物 4 和引物 5 做連線 PCR 將目的基因和間隔子連線起來，引物5含有SD序列, 引物4含有3′端莖環結構序列。

③ PCR產物再進行延伸PCR,引物6含有T7啟動子序列和5′端莖環結構序列,下游產物同前。最後得到的PCR產物,5′端接上T7啟動子和莖環結構以及SD序列,3′端則融合了間隔序列並含有3′端的莖環結構

體外轉錄和翻譯

1）體外表達可以利用來自原核的E.coliS30無細胞蛋白質合成系統,或真核的兔網織紅細胞裂解液和麥胚提取物的蛋白質合成系統,至於何種系統更適合,目前尚有爭議.體外轉錄與體外翻譯可以偶聯進行,也可以分別進行.目前,已有以DNA 為模板的體外蛋白翻譯系統和以RNA為模板的體外轉錄與翻譯偶聯的商用系統問世。

對於含二硫橋的ScFv抗體和其他蛋白質,轉錄和翻譯應分別進行,因為含有二硫橋的蛋白質要在氧化條件下才能正確摺疊,但轉錄時,T7 RNA聚合酶要求具還原性的β-巰基乙醇維持其穩定性。如果目標蛋白在還原性條件下能正確摺疊,則體外轉錄/翻譯偶聯體系效果可能更好.。

2）若分別進行,則需要控制RNase的影響.VRC—過渡態類似物—作為RNase抑制劑,能有效抑制核酸酶,提高E.coli核糖體展示效率。翻譯結束後立即冷卻反應混合物,所有篩選步驟在冰上進行降低RNase的影響。另外,3′端和5′端的莖環結構也可以使mRNA避免核酸外切酶RNaseⅡ和核酸內切酶RNase E的影響。

親和篩選

體外翻譯反應結束後,將翻譯混合物稀釋4倍終止反應。反應試劑中始終保持5 mmol/L Mg2+濃度，穩定mRNA-核糖體-蛋白質三元複合體。可以直接用於篩選實驗，也可以於4℃保存，核糖體複合物在4℃至少可以穩定10 d，但產量會逐漸減少。體外篩選時加入1%~2%脫脂奶粉和0.2%肝素可以降低抗原-抗體的非特異性反應,肝素還能抑制核酸酶。

①親和篩選

分為固相篩選和液相篩選，主要有ELISA和磁珠法。Hanes等認為,ELISA方法中，抗原包被在塑膠表面上，而塑膠表面的疏水作用有可能會影響吸附蛋白的空間構象，從而導致篩選出的抗體分子不能識別抗原的天然表位;磁珠法是在抗原上連線捕獲標籤，如生物素，然後在形成抗原-抗體複合物後,採用磁珠-鏈霉親和素捕獲該標籤,進行親和篩選。

②mRNA的分離

篩選完後，加入含20 mmol/LEDTA的冰冷緩衝液洗脫mRNA。洗脫下來的mRNA用DNaseⅠ處理去除殘留的DNA模板，進行RT-PCR反應重新引入T7啟動子，SD序列等核糖體展示必需元件用於下一輪展示或直接進行Northern雜交，評價篩選效率。將最後一輪篩選到的靶標基因與質粒連線,轉化到大腸桿菌中，可以得到單個靶標克隆。進一步採用體外或體內(分泌型或包涵體型)表達方式表達單鏈抗體分子,進行活性鑑定。

體外分子定向進化

用核糖體展示技術對未變異的文庫進行篩選時,可以通過易錯PCR或(DNA shuffering)等方法引入突變和重組技術,增加分子多樣性,從而提高獲得高親和力、良好穩定性或增加酶活性靶標分子的機率.Plückthumx小組利用核糖體展示技術篩選到1.1 nmol高親和力的ScFv,之後通過引入DNA重排技術,又將其親和力提高。

優勢

核糖體展示技術完全在體外進行,與噬菌體或酵母菌展示技術相比具有建庫簡單、庫容量大、分子多樣性強、篩選方法簡便、無需選擇壓力,還可通過引入突變和重組技術來提高靶標蛋白的親和力等優點,是一種篩選大型文庫和獲取分子進化強有力的方法。

問題

如何進一步地提高該系統的穩定性；特別是如何防止mRNA的降解和形成穩固的蛋白質-核糖體-mRNA三聚體無疑是該技術的關鍵問題；如何提高大分子蛋白質在核糖體上的展示也是未來研究需要關注的問題。

前景

隨著對核糖體展示技術的進一步研究,以上問題將逐步得到解決,核糖體展示技術作為一種新興的克隆展示技術,必將在蛋白質相互作用研究、新藥開發以及蛋白組學等方面顯示出更為廣泛的套用空間.。

核糖體展示技術