《核糖核酸及其製備方法與套用》是吉林敖東藥業集團延吉股份有限公司於2007年6月1日申請的發明專利，該專利的公布號為：CN101058595，專利公布日：2007年10月24日，發明人：孫德軍、 霍英、李夏、李秉安、 禹學軍。
《核糖核酸及其製備方法與套用》公開了核糖核酸及其製備方法與套用。該發明所提供的核糖核酸的製備方法，是將新鮮胰臟加入水勻漿，勻漿液與飽和苯酚混勻、攪拌，徹底破碎細胞，變性蛋白質，離心分離水相，水溶液加入氯仿抽提，離心分離水相，水相加入乙醇沉澱核糖核酸。該發明採用氯仿－異丙醇為提取溶劑，能有效提取出牛胰腺中的核糖核酸，該提取過程的生產周期短，提取過程可在16～18時間內完成，核糖核酸的提取率為3.0～4.8克/千克胰臟，純度OD260/OD280＞1.9，較2007年6月前的核糖核酸提取工藝大大縮短了提取時間，產量提高1～2倍，由於核糖核酸提取效率的提高，脫氧核糖核酸“污染”含量降低，批成品率提高30％左右，批報廢率由30％降低到零，成本降低70％左右；產品經過病毒滅活步驟，安全性更易於保證。
2017年12月11日，《核糖核酸及其製備方法與套用》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：核糖核酸及其製備方法與套用
- 公布號：CN101058595
- 授權日：2007年10月24日
- 申請號：200710099981X
- 申請日：2007年6月1日
- 申請人：吉林敖東藥業集團延吉股份有限公司
- 地址：吉林省延吉市高新技術開發區長白路389號
- 發明人：孫德軍、 霍英、李夏、李秉安、 禹學軍
- Int. Cl.：C07H21/02(2006.01)、C07H1/08(2006.01)、A61K31/7105(2006.01)、A61P37/02(2006.01)
- 專利代理機構：北京紀凱智慧財產權代理有限公司
- 代理人：關暢
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
核糖核酸是動物體內一種生物大分子，是一種重要的免疫觸發劑或免疫調節劑。1967年通過肉瘤免疫綿羊製取的淋巴細胞核糖核酸對大鼠進行試驗，發現核糖核酸能抑制荷瘤鼠腫瘤的生長，甚至消除，首次證實了免疫核糖核酸能傳遞免疫信息。1982年林單坤等人把從免疫羊肝中提取得到的核糖核酸做成製劑注入體內，發現對腫瘤與癌症有明顯的療效並能提高機體的免疫功能，而且未出現不良的副作用。從脾臟中提取得到的免疫核糖核直接製成針注入體內，可激活人體的T細胞及B細胞的活性；同時有提高人體免疫功能的作用，對一些與人體免疫功能下降有關的疾病，如慢性支氣管炎、哮喘病、慢性乙型肝等，以及胃癌、乳腺癌、大腸癌等惡性腫瘤有顯著的療效。雖然免疫核糖核酸在國內已經用於臨床治療，但在生產工藝方面仍然存在一定的問題，給推廣帶來一定的難度。
中國專利CN1116879C曾描述了從牛脾臟製備核糖核酸的方法，受當時條件限制，有些不足：
1.由於工藝中使用SDS可能造成殘留，並可能使DNA從組蛋白上解離下來，造成DNA含量超標，RNA含量為95-96％左右；
2.生產周期過長，生產效率低，整個提取步驟大約需要一周時間；
3.收率低，約為1克核糖核酸/公斤胰臟。
發明內容
專利目的
《核糖核酸及其製備方法與套用》的目的是提供一種生產周期短、污染小、成本低、高活性的核糖核酸製備方法。
技術方案
《核糖核酸及其製備方法與套用》所提供的核糖核酸的製備方法，包括如下步驟：
1、提取原液的製備
將動物胰腺小塊絞碎後移入膠體磨，加入提取緩衝液進行研磨，得到提取原液；所述提取緩衝液為0.01～0.10摩爾/升Tris-乙酸緩衝液，pH4～8；
2、核糖核酸的提取
提取原液加入0.2～10倍體積飽和酚液體的上層水相，和0.2～10倍體積的飽和酚液體的下層酚相，加熱到40～80℃，恆溫30～180分鐘；然後，在4～10℃下離心，收集上清液；所述飽和酚液體是將苯酚融化後，加入等體積的步驟1所述提取緩衝液，攪拌均勻後得到的；上清液加入0.5～2倍體積的氯仿-異戊醇溶液，搖勻5～30分鐘，在4～10℃下離心，收集上清液；上清液加入0.2～2倍體積氯仿-異戊醇，搖勻後在4～10℃離心，收集含核糖核酸的上層上清液，所述氯仿-異戊醇溶液中氯仿與異戊醇的體積比為10～50:1；上清液加入0.1～1體積助沉澱緩衝液，再加入2～6倍體積95％乙醇，搖勻，4℃放置過夜，在4～10℃下離心，收集得到核糖核酸沉澱；助沉澱緩衝液為1-5摩爾/升乙酸鈉溶液，pH為3-6。
為了能進一步提高核糖核酸的純度，減少雜質含量，動物胰腺小塊在絞碎前，還要去除非胰腺組織。核糖核酸沉澱還以溶解緩衝液溶解，加乙醇至乙醇終濃度為50～85％，在4～10℃離心；然後，以70-80％乙醇洗滌，並在4～10℃下離心；所述溶解緩衝液為0.5-1兆NaCl溶於0.025-0.075兆Tris-HCl緩衝液中，pH9.5。在製備過程中，離心的加速度為2000～10000克，優選為4000克。
《核糖核酸及其製備方法與套用》所製備的核糖核酸，還可以製備出一種注射用核糖核酸凍乾製劑。該注射用核糖核酸凍乾製劑，是按如下過程製備的：
1、製備注射用核糖核酸中間體
將核糖核酸和右旋糖酐混合，攪拌均勻，控制溶液調節pH值為6.5～7.5，其中，核糖核酸和右旋糖酐的重量比為1:1～3；然後，加入溶液重量0.1～0.8％的活性炭，混勻、脫色，加注射用水至所需量，使得溶液中核糖核酸濃度為20～30克/升，右旋糖酐濃度為30～60克/升；再依次經孔徑為0.3-0.5微米的第一微孔濾膜及孔徑為0.1-0.3微米的第二微孔濾膜過濾除菌，得到注射用核糖核酸中間體。
2、病毒滅活
將所得注射用核糖核酸中間體在50～80℃恆溫6～12小時，滅活病毒。
3、凍乾
將經病毒滅活後的注射用核糖核酸中間體放置凍乾箱中，-50至-30℃預凍2～3小時，-30至-20開始升華，真空度≤20帕；然後，在20-40℃乾燥，得到所述注射用核糖核酸凍乾製劑。優選的，第一微孔濾膜的孔徑為0.45微米；第二微孔濾膜的孔徑為0.22微米。
改善效果
《核糖核酸及其製備方法與套用》採用氯仿-異丙醇為提取溶劑，能有效提取出動物胰腺中的核糖核酸，該提取過程的生產周期短，基本上在16～18時間內即可以完成提取過程；提取率高，能達到3.0～4.8克核糖核酸/千克胰臟的收率，相比2007年前的技術所提取的核糖核酸，提高了1～2倍，成本降低70％左右；產品的純度高，其中RNA含量在98-99.7％左右；套用所製備的核糖核酸來生產注射用核糖核酸凍乾製劑，產品經過病毒滅活步驟，安全性更易於保證。
技術領域
《核糖核酸及其製備方法與套用》涉及核糖核酸及其製備方法與套用。
權利要求
1、核糖核酸的製備方法，包括如下步驟：
1）提取原液的製備將動物胰腺小塊絞碎後移入膠體磨，加入提取緩衝液進行研磨，得到提取原液；所述提取緩衝液為0.01～0.10摩爾/升Tris-乙酸緩衝液，pH4～8；
2）核糖核酸的提取
提取原液加入0.2～10倍體積飽和酚液體的上層水相，和0.2～10倍體積的飽和酚液體的下層酚相，加熱到40～80℃，恆溫30～180分鐘；然後，在4～10℃下離心，收集上清液；所述飽和酚液體是將苯酚融化後，加入等體積的步驟1）所述提取緩衝液，攪拌均勻後得到的；上清液加入0.5～2倍體積的氯仿-異戊醇溶液，搖勻5～30分鐘，在4～10℃下離心，收集上清液；上清液加入0.2～2倍體積氯仿-異戊醇，搖勻後在4～10℃離心，收集含核糖核酸的上層上清液，所述氯仿-異戊醇溶液中氯仿與異戊醇的體積比為10～50:1；上清液加入0.1～1體積助沉澱緩衝液，再加入2～6倍體積95％乙醇，搖勻，4℃放置過夜，在4～10℃下離心，收集得到核糖核酸沉澱；助沉澱緩衝液為1-5摩爾/升乙酸鈉溶液，pH為3-6。
2、根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於：所述動物胰腺小塊在絞碎前，還要去除非胰腺組織。
3、根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於：所述核糖核酸沉澱還以溶解緩衝液溶解，加乙醇至乙醇終濃度為50～85％，在4～10℃離心；然後，以70-80％乙醇洗滌，並在4～10℃下離心；所述溶解緩衝液為0.5-1兆NaCl溶於0.025-0.075兆Tris-HCl緩衝液中，pH9.5。
4.根據權利要求1或2或3所述的製備方法，其特徵在於：所述離心的加速度為2000～10000克。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於：所述離心的加速度為4000克。
實施方式
- 實施例1 製備核糖核酸
一、配製溶液
（1）提取緩衝液（0.02兆Tris-乙酸緩衝液）
900毫升純化水，加2.42克Tris，用乙酸調pH5.0，定容至1000毫升。
（2）飽和酚液體
將苯酚在50℃融化，加入等體積提取緩衝液，攪拌均勻製成飽和酚溶液，避光保存。
（3）助沉澱緩衝液
3兆乙酸鈉溶液，pH5.0。
（4）溶解緩衝液
1兆NaCl溶於0.05兆Tris-HCl緩衝液中，pH9.5。
二、提取過程
1、原材料選擇和預處理
取小牛（1歲半以下）胰腺50公斤在25℃左右去筋膜、脂肪及結締組織等非胰腺組織，用純化水清洗乾淨，切成3～5厘米小塊。
2、組織及細胞的破碎
用乾淨絞肉機將胰腺小塊絞碎，將絞碎的小牛胰腺移入膠體磨中，加入等量提取緩衝液，第一次以200微米破碎研磨，第二次以50μ研磨，真空下，研磨液應較易通過200目不鏽鋼網，得到100千克左右的勻漿液。
3、有效成份提取
勻漿液加入1倍體積飽和酚液體的上層水相，加入0.5倍體積飽和酚液體的下層酚相，加熱到60℃，恆溫120分鐘，迅速冷卻，在4～10℃離心（4000克，30分鐘），收集上清液，棄去沉澱（回收苯酚）。上清液加入0.6倍體積氯仿-異戊醇（體積比24:1），搖勻15分鐘，在4～10℃離心（4000克，30分鐘），收集上層的上清液，棄去中間層沉澱，回收底層氯仿層。上清液加入0.3倍體積氯仿-異戊醇（體積比24:1），搖勻15分鐘，在4～10℃離心（4000克，30分鐘），收集含核糖核酸的上層上清液，棄去中間層沉澱，回收底層氯仿層。上清液加入1倍體積助沉澱緩衝液，再加入2倍體積乙醇（95％），搖勻，4℃放置過夜，在4～10℃離心（4000克，30分鐘），收集核糖核酸沉澱，上層的上清液為乙醇，回收乙醇。為了能進一步提高核糖核酸的純度，減少雜質含量，核糖核酸沉澱以溶解緩衝液溶解，加入乙醇至終濃度75％（質量），在4～10℃下離心（4000克，30分鐘）。用75％乙醇反覆洗滌沉澱2次，在4～10℃離心（4000克，30分鐘），收集核糖核酸沉澱，置50℃水中放置到無醇味（約1小時）。以上過程提取過程可在16～18時間內完成，核糖核酸的提取率為3.8克/千克胰臟，較2007年前的核糖核酸提取工藝大大縮短了提取時間，產量提高1～2倍。在核糖核酸提取過程中，總會帶有少量DNA雜質，由於DNA分子一般均比較大，注射時會間接引起過敏反應。
《核糖核酸及其製備方法與套用》由於核糖核酸提取效率的提高，核糖核酸產品中RNA含量在99.7％左右，純度0D260/0D280＞1.9，相比2007年前的技術所提取得到的產品（RNA含量為95-96％），產品純度有了很大的提高，脫氧核糖核酸“污染”含量降低，能提高產品安全性；並且，提取過程批成品率提高30％左右，批報廢率由30％降低到零，成本降低70％左右。
- 實施例2 製備核糖核酸
一、配製溶液
（1）提取緩衝液（0.06兆Tris-乙酸緩衝液）
900毫升純化水，加7.26克Tris，用乙酸調pH7.0，定容至1000毫升。
（2）飽和酚液體
將苯酚在50℃融化，加入等體積提取緩衝液，攪拌均勻製成飽和酚溶液，避光保存。
（3）助沉澱緩衝液
3兆乙酸鈉溶液，pH5.0。
（4）溶解緩衝液
1兆NaCl溶於0.05兆Tris-HCl緩衝液中，pH9.5。
二、提取過程
1、原材料選擇和預處理
取仔豬（6-10月）胰腺50公斤在25℃左右去筋膜、脂肪及結締組織等非胰腺組織，用純化水清洗乾淨，切成3～5cm小塊。
2、組織及細胞的破碎
用乾淨絞肉機將胰腺小塊絞碎，將絞碎的仔豬胰腺移入膠體磨中，加入等量提取緩衝液，第一次以200微米破碎研磨，第二次以50μ研磨，真空下，研磨液應較易通過200目不鏽鋼網，得到125千克左右的勻漿液。
3、有效成份提取
勻漿液加入8倍體積飽和酚液體的上層水相，加入0.4倍體積飽和酚液體的下層酚相，加熱到60℃，恆溫120分鐘，迅速冷卻，在4～10℃離心（4000克，30分鐘），收集上清液，棄去沉澱（回收苯酚）。上清液加入1.5倍體積氯仿-異戊醇（體積比30:1），搖勻15分鐘，在4～10℃離心（4000克，30分鐘），收集上層的上清液，棄去中間層沉澱，回收底層氯仿層。上清液加入1倍體積助沉澱緩衝液，再加入4倍體積乙醇（95％），搖勻，4℃放置過夜，在4～10℃離心（4000克，30分鐘），收集核糖核酸沉澱，上層的上清液為乙醇，回收乙醇。為了能進一步提高核糖核酸的純度，減少雜質含量，核糖核酸沉澱以溶解緩衝液溶解，加入乙醇至終濃度75％（質量），在4～10℃下離心（4000克，30分鐘）。用75％乙醇反覆洗滌沉澱2次，在4～10℃離心（4000克，30分鐘），收集核糖核酸沉澱，置50℃水中放置到無醇味（約1小時）。
以上過程提取過程可在16～18時間內完成，核糖核酸的提取率為4.8克/千克胰臟，較已有的核糖核酸提取工藝大大縮短了提取時間，產量提高1～2倍；核糖核酸產品中RNA含量在99％左右。
- 實施例3 製備注射用核糖核酸
1、製備注射用核糖核酸中間體
取核糖核酸（實施例1提取得到）50克，加入右旋糖酐90克，加入1800毫升的水，攪拌均勻，用1摩爾/升Tris溶液調節pH值為6.5～7.5（20℃～22℃）。加入溶液重量0.1％的針用活性炭，混勻，40℃脫色15分鐘。添加注射用水至2000毫升，經0.45微米微孔濾膜精濾及0.22微米微孔濾膜過濾除菌至澄明，得到注射用核糖核酸中間體。測定其pH值為7.2，含量為25毫克/毫升，細菌內毒素＜10EU。
2、病毒滅活（巴氏滅活）
取注射用核糖核酸中間體，60℃10小時恆溫，滅活病毒。
3、製備注射用核糖核酸
按含量要求，將藥液灌裝於西林瓶中，放置凍乾箱中，-40℃預凍2～3小時，-30℃開始升華，約15小時，真空度≤20帕。乾燥溫度約30℃，經約5小時後，乾燥（殘留水分≤3.0％），得到注射用核糖核酸製劑。
二、產品檢測
1、光譜學特徵
在190～360納米波長範圍，對所得注射用核糖核酸中間體進行紫外吸收掃描，結果顯示在258納米有最大吸收，在230納米吸收峰最小，A260/A230、A260/A280的比值分別達到2.1和1.9以上，巴氏滅活後光譜學特徵沒有改變。2、RNA特性
RNA中的核糖與酸作用生成糠醛，後者再與3，5二羥基甲苯作用產生綠色物質。根據這一特性，取3，5二羥基甲苯鹽酸溶液，在80℃水浴中加熱，進行RNA特性檢測。結果表明，所得注射用核糖核酸中間體有綠色反應，說明病毒滅活後RNA特性沒有改變。
3、增色效應
RNA在強鹼溶液中可使核酸鏈斷裂、吸光度增加的原理，做了增色效應檢測，注射用核糖核酸中間體增色效應達到35％以上，進行病毒滅活後增色效應有1～2％減小，仍符合國藥標準大於20％的質量要求。
4、病毒滅活效果
取出液氮內凍存的BHK21細胞，置37℃水浴，全融後開封，移入含MEM營養液的細胞培養瓶內，置37℃培養，使細胞長成單層，傳代培養。病毒滴度採用細胞病變培養法，在96孔板上進行滴定，樣品用MEM營養液10倍系列稀釋，每一稀釋度接種6孔，滴定結果按karber法計算TCID50。取注射用核糖核酸中間體900毫升，分別加入指示病毒100毫升，混勻，取出30毫升作病毒滅活前陽性病毒滴度檢測。然後在60℃10小時恆溫滅活病毒，分別在30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時取樣，用0.22微米膜除菌後密封，-65℃保存，同時設藥液陰性對照組，測定病毒滴度。
結果表明，經病毒滅活後，滅活液中均未檢測出病毒，經盲傳三代，亦均未見特異性細胞病變（CPE），這表明所採用的滅活方法的滅活效率高，能夠保障產品的安全性。
5、產品活性測定
如何對核糖核酸生物活性進行檢測，尚未得到滿意的解決方案。正常白細胞都具有粘附於玻璃、塑膠表面的特性，但在特異因子作用下，正常白細胞的這種粘附能力可顯著降低，這種反應稱為白細胞粘附抑制反應，一般以抑制率＞20％為有意義。《核糖核酸及其製備方法與套用》採用正常白細胞給予一定濃度核糖核酸來誘發白細胞的粘附抑制反應，通過小鼠白細胞粘附的抑制率來表征核糖核酸的生物活性，抑制率越高，說明核糖核酸的生物活性越高。
1）溶液配製
培養液含10％小牛血清的RPMI-1640培養液，用Hepes和碳酸氫鈉調節PH值至7.2～7.4，過濾除菌後-20℃保存。紅細胞分離液（0.83％NH4Cl-Tris緩衝溶液）：0.17摩爾/升Tris（20.60克/1000毫升）10.0毫升與0.16摩爾/升NH4Cl（8.30克/1000毫升）90.0毫升混勻，用1摩爾/升HCl調pH至7.2，4℃保存備用。供試品溶液：取注射用核糖核酸凍乾製劑（實施例3製備），用培養液製成每1毫升中含核糖核酸5毫克的溶液，作為供試品溶液；對照組溶液：培養液。
2）小鼠脾細胞懸液的製備
取小鼠拉脫頸椎或放血而死，用碘酒、酒精處理皮毛。剪開皮膚，打開腹腔。在胃底部找到紅色的脾，用鑷子分離後摘除。脾經培養液洗滌後，置50～300（200）目不鏽鋼網上，用剪刀剪成數塊，用注射器柄擠壓研磨，低速離心（1000轉/分鐘），懸起沉澱部分即得脾細胞懸液。若其中有較多紅細胞，可將脾細胞懸液放在5毫升預冷的0.83％NH4Cl-Tris緩衝溶液中，置37℃水浴中10分鐘，低速離心（1000轉/分鐘）收集沉澱白細胞。
3）測定方法
在96孔培養板中進行，供試品孔及對照組孔各做三孔。每孔各加溶液50微升，然後每孔加小鼠脾細胞懸液50微升；將培養板於二氧化碳培養箱中，37℃孵化2小時，使細胞在培養板底部粘附，取出細胞培養板，用震盪器在低強度下搖30～60秒，將未粘附細胞搖起，吸出上清液（組間再震盪一次保證均勻），移至另一孔，每孔再加入培養液液50微升按上法洗一次，將洗液與上清液合併（注意勿起氣泡），在酶標儀上，在405納米波長下測定每孔的吸收值，作為粘附後細胞的吸收值。另取溶液50微升，加小鼠脾細胞懸液50微升混勻，再加50微升培養液，在405納米波長下測定吸收度值，做為粘附前細胞的吸收值。
按下式計算粘附率和粘附抑制率：粘附率＝（粘附前細胞的吸收度值-粘附後細胞的吸收度值）/粘附前細胞吸收度信×100％；粘附抑制率＝（對照品粘附率-供試品粘附率）/對照粘附率×100％。
4）測定結果
對照組粘附率＝（對照組粘附前細胞的吸收度值-對照組粘附後細胞的吸收度值）/對照組粘附前細胞吸收度值×100％＝1.405-0.912/1.405＝35％；
供試品粘附率＝（供試品粘附前細胞的吸收度值-供試品粘附後細胞的吸收度值）/供試品粘附前細胞吸收度值×100％＝0.701-0.528/0.701＝24.6％；
粘附抑制率＝（對照組粘附率-供試品粘附率）/對照組粘附率×100％＝35％-24.6％/35％＝29.7％。
以上結果說明，《核糖核酸及其製備方法與套用》所提取的核糖核酸具有良好的活性。2007年前的技術提取（中國專利CN1116879C）的核糖核酸的粘附抑制率為17-23％。
榮譽表彰
2017年12月11日，《核糖核酸及其製備方法與套用》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
