木瓜凝乳蛋白酶

木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、鹼性環境下均能分解蛋白質的蛋白酶。它的外觀為白色至淺黃色的粉末，微有吸濕性。它既有很強的蛋白水解催化活性又含凝乳和溶菌活性,還具脂解能力及蛋白合成功能,主要是催化蛋白質水解,也能分解小肽。它的切割分解點很多,大致優先分解精氨酶,苯丙氨酸的肽鍵。

基本介紹

• 中文名：木瓜凝乳蛋白酶
• 外文名：Chymopapain
• 性質：蛋白酶
• 特點：蛋白水解催化活性

介紹

1941年，Jansen等首先從木瓜乳汁中提取到一種新半胱氨酸酶，並根據其凝乳能力與蛋白質水解能力之比是木瓜蛋白酶二倍的特點把它命名為木瓜凝乳蛋白酶。

木瓜凝乳蛋白酶(Papain由番木瓜乳液（papayalatex）分離而得的巰基蛋白酶末。分子量36000。PH值10.1。易溶於水，在低於PH值1.8溶液中十分穩定，最適PH值2.5～4.0。為一種蛋白水解酶。蛋白分解活性是木瓜蛋白酶的兩倍。目前套用較多的是它的蛋白分解活性和凝乳作用。

木瓜凝乳蛋白酶可用於Rh血型的鑑定、啤酒的澄清和乳酪的製造等方面，然而其最主要的用途是治療腰椎間盤突出症。臨床用於抗炎消腫和治療椎間盤病。最適pH6.0～8.0,最適溫度70℃左右,半胱氨酶,硫化物,亞硫酸鹽,乙二胺四乙酸能增加它的功效,人們常用此類物質促進它作用。表面活性物質(如去污劑、洗衣粉),氧化劑(如雙氧水),有機溶劑(如石油醚、酒精),重金屬鹽,強酸、強鹼乃至抗壞血酸,及各種微生物污染都能使它失活,應儘量避免接觸。

結構

結構與木瓜乳汁中其他酶類似
現已發現木瓜乳汁中含有4種半胱氨酸酶:木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)、caricain(EC3.4.22.30)、glyeylendopeptidase(EC3.4.22.25)和木瓜凝乳蛋白酶(EC3.4.22.6)。作為4種已知半胱氨酸酶之一，木瓜凝乳蛋白酶與其他3種酶在胺基酸序列、肽鏈結構、活性中心和二硫鍵的保守性以及酶學性質等方面都有著很大的相似性，尤其是和木瓜蛋白酶第一樣具有凝乳和蛋白質水解特性。

1967年，Kunimitsu等根據木瓜凝乳蛋白酶從離子交換柱洗脫的先後順序把它分為木瓜凝乳蛋白酶A和木瓜凝乳蛋白酶B。B型與雙質子態探針反應的二級速度常數K與pH的關係曲線與其他半胱氨酸酶的類似，在pH為3~4時K最大，在pH為6時K最小，在大約pH為9的鹼性介質中，K略高，曲線平緩。而在A型的pH-K曲線中，在低pH時的鐘形曲線的頂部消失了。pH-K曲線的不同及某些pH對應K值的不同是鑑別這兩種不同類型酶的簡單而有效的方法。正由於它們催化活性位點的特徵不同，即使木瓜凝乳蛋白酶的名樣性被發現後，這種A、B分類法仍然被沿用。

木瓜凝乳蛋白酶的結構與其他3種半胱氨酸酶類似，木瓜凝乳蛋白酶肽鏈的N末端有信號肽段和肽原段。信號肽指導木瓜凝乳蛋白酶向特異性細胞器分泌;肽原段不僅可以輔助酶肽鏈的摺疊，可作為木瓜凝乳蛋白酶高親和力的抑制劑，防止木瓜凝乳蛋白酶不合時宜地分解植物體內的其他蛋白質。

多數木瓜凝乳蛋白酶的多肽鏈由218個胺基酸組成，也有幾種是由227個胺基酸組成的。多肽鏈摺疊後，形成大小相當形狀不同的兩個域，L域和R域。L域主要是α螺旋結構，R域主要是反向平行的β摺疊結構。活性部位位於兩域的接觸面上，活性中心的Cys5位於L域內由24~42殘基構成的α螺旋上。
多肽鏈的8個半胱氨酸中有6個配對構成3個二硫鍵。位於必需活性位點的Cys25和位於非必需活性位點的Cys117沒有參與二硫鍵的形成。具有催化功能的Cys25和保守的Cys23和Cys65組成了S1微場所。由於S1微場所的“口袋”比較大，對酶的底物特異性幾乎沒影響。目前認為由67、68、69、133、157和207幾個位點的殘基構成的S2微場所影響著酶的底物特異性。在其他3種半胱氨酸酶的S2微場所中高度保守的Val33和Val57在木瓜凝乳蛋白酶中被Leu所代替，這兩個Leu很大程度上改變了S2微場所的幾何形狀，從而影響著酶的特性。

性質

鹽酸胍廣泛用於檢測蛋白質可逆伸展的構象穩定性。木瓜凝乳蛋白酶的天然構象是其水解酪蛋白的最佳作用狀態。鹽酸胍的加入可能使木瓜凝乳蛋白酶的硫氫鍵氧化為二硫鍵，酶[7活降低。甘油糖和聚乙二醇是多羥基的化合物，能形成很多氫鍵而對酶往往會有穩定作用。研究表明葡萄糖對木瓜凝乳蛋白酶有激活作用，而甘油和聚乙二醇卻對其有抑制作用。木瓜凝乳蛋白酶具有較高的熱穩定性，比其他3種酶都高，這可能與其在117位有一個自由的胱氨酸殘基有關。從研究結果來看，木瓜凝乳蛋白酶在經過較高的溫度處理後仍有酶活，值得進步開發利用。

酶的熱穩定性

在pH7.0條件下，分別將酶放於60°C、70°C、80°C，每隔0.5h抽取一定量的酶液測定其活性。結果表明在80C條件下酶活性明顯下降，在60攝氏度條件下酶活性接近原來的一半。

鹽酸胍對酶活的影響

在酶液中分別添加不同低濃度的鹽酸胍，測定其酶活。結果表明，低濃度的鹽酸胍對木瓜凝乳蛋白酶沒有激活作用，而有明顯的抑制作用。

葡萄糖對酶活的影響

檢測結果表明,不同濃度的葡萄糖對酶均有激活作用，在濃度為2%~4%之間最明顯，當濃度大於6%以上，其激活作用趨於穩定。

特性

Cp（Chymopapain，木瓜凝乳蛋白酶）既有很強的蛋白水解催化活性又含凝乳和溶菌活性,還具脂解能力及蛋白合成功能,主要是催化蛋白質水解,也能分解小肽。它的切割分解點很多,大致優先分解精氨酶,苯丙氨酸的肽鍵。

熱穩定性

Cp的熱穩定性與其結構有關。Sumner等人的比較了Cp和其它三種酶的熱穩定性，其順序為:Cp>木瓜蛋白酶 Ω>木瓜蛋白酶>木瓜凝乳酶M。分析發現，它們的熱穩定性 與Pro/Gly 的比值有關，但Cp的穩定性要比根據Pro/Gly比值預測的高，這可能與它在117位有一個自由的胱氨酸殘基有關。Philppe 等人10J用麥芽糖加上保護劑和Cp一起凍乾，在室溫下儲存三年其活力保持恆定。

pH穩定性

Cp具有較好的低pH穩定性。在pH為3時仍有活力，而其它三種酶卻已失活。Silvia 等人們專門研究了Cp在pH為1.1~ 3.0的高溫失活動力學，發現其熵和焓的變化很大，而其它酶則不具有此特性。Daumantas 等人口還用芳香族磺化反應來保護Cp,避免它在酸性和高溫環境中失活。

同源性

Cp和其它疏基蛋白酶一級結構比較同種類的Cp其級結構都相同，由218個胺基酸組成。它和其它三種酶有高度的同源性。它們的胺基酸序列比較如圖1所示。木瓜蛋白酶的212個胺基酸殘基中有127個和Cp相同，木瓜蛋白酶Q的216個胺基酸殘基中有144個和Cp相同，木瓜凝乳酶M的216個胺基酸殘基中有148個和Cp相同。Cp和木瓜蛋白酶Q、木瓜凝乳酶M一樣在木瓜蛋白酶的168和169位之間有4個胺基酸殘基，這些胺基酸殘基延長了兩個相鄰的β片層。Cp中有8個胱氨酸和半胱氨酸殘基，而其它三種酶只有7個胱氨酸殘基。25 位的胱氨酸是活性位點殘基，153和204.22和63、56和95位的半胱氨酸分別形成三個二硫鍵，並具有同樣的保守性。Cp的117位的胱氨酸是自由巰基，不形成硫鍵。木瓜蛋白酶所必 需的活性殘基Cys25、Asp158、His159.Trp177、Asn175在Cp和其餘兩種酶中都存在。另外在Cp的C-未端還有兩個殘基(Phe217和Ala218)。

製備

木瓜凝乳蛋白酶是一種胞外酶，能分泌到乳汁中，所以可以直接從未成熟木瓜乳汁中用色譜柱法分離純化。但由於木瓜凝乳蛋白酶和其他3種半胱氨酸酶的結構相似，而且自身又含有多種類型，所以提取高純度的木瓜凝乳蛋白酶非常困難，不同條件下提取的木瓜凝乳蛋白酶經常含有不同的雜蛋白質。已證明早期的木瓜凝乳蛋白酶製劑中就含有其他蛋白酶，過敏反應在很大程度上是這些雜蛋白質引起的。

Mark曾成功地將木瓜凝乳蛋白酶的基因重組到大腸桿菌中，得到的木瓜凝乳蛋白酶84%具有活性。

套用

國際上作工業用途的木瓜酶都指末純化品,是成分複雜的多酶體系,蛋白電泳帶大多在5條以上;其中含木瓜蛋白酶,木瓜凝乳蛋白酶A和B(ChymopapainAandB),木瓜肽酶A(PapayapeptidaseA)。木瓜酶廣泛套用於輕紡、食品、啤酒、飼料、化工及醫藥。

輕紡方面

常用於絹絲脫膠和羊毛防縮,據我們的經驗,可選用每毫升200單位(改良勞力法,下同)的酶液於pH7.0,70℃處理絹絲,絹織品、生絲、絹麻、絹及絹與醋酸纖維之類的混紡織物,時間大約30～40分鐘,此法還可用到榨蠶絲、粗巢絲。套用工藝大致如下(因原料、方法不同而有所差異): 前處理→擰乾→精煉→擰乾→後處理→溫水洗→水洗

由於木瓜蛋白酶只溶解絲膠而對纖維蛋白全無作用,所以能令絲織物等滑爽柔軟。

羊毛防縮需作表面處理以脫去膠質或減少膠質含量。一般需先用木瓜酶加活化劑並用有機溶劑處理,隨後以聚亞胺脂類作用。國外常用毛纖維含量1200%的C2Cl2,0.5%60萬單位的木瓜酶和單乙醇胺、焦亞硫酸鹽,60℃處理10分鐘,甩乾後浸入1200%C2Cl2和合成漿料LKF室溫作用6分鐘,清洗乾燥後,羊毛及毛織物的收縮率將從對照的16%降到0～2.5%。

醫藥套用

木瓜凝乳蛋白酶最主要的用途是治療腰椎間盤突出症。其作用機制是減少髓核中連線長鏈粘多糖的非膠原蛋白質的分子量和粘稠度，使粘蛋白發生去聚合作用，從而溶解突出的髓核。

1964年，Smith首次將木瓜凝乳蛋白酶用於治療腰椎間盤突出症，成功率為70%。到目前為止，美國、加拿大、澳大利亞及歐洲的一些國家已有60餘萬患者接受了木瓜凝乳酶溶核術治療。我國的灤波8和金今[9等用韓國新豐製藥公司生產的木瓜凝乳蛋白酶進行治療腰椎間盤突出的臨床研究，也分別得到了70%和89%的優良率。將木瓜凝乳蛋白酶與其他手術相結合治療腰椎間盤突出，可提高療效和減少因注射部位不準確而引起的併發症，從而提高優良率。

木瓜凝乳蛋白酶治療腰椎間盤突出症有時會引起嚴重的併發症，如過敏反應和神經系統併發症，這使它的套用受到了一定的限制。治療前詢問病人的過敏史、做過敏試驗以及治療過程的嚴格操作是及其重要的。

可將木瓜酶與其他成分配伍做成腸溶膠囊,口服達抗炎、消腫目的;也可將木瓜酶單獨做成片劑、含片劑用於驅除腸道寄生蟲或接觸消炎;還可用木瓜酶將動植物蛋白水解成危重病人易於吸收的水解蛋白。

一些化工廠以明膠、骨膠作原料,100公斤原料粉碎後加水至濕潤,用1公斤60萬單位/g的木瓜酶粉與原料充分拌勻,於60℃水解40分鐘,冷卻後再加熱一次至沸騰,加水助濾榨出濾液即為水解蛋白液,將此液去熱源、滅菌,可供病人作輸液用。

如做成每片含相當於50mg木瓜蛋白酶,2g膽木,1g田七的藥片,能用於治療骨外傷和痔瘺病患等,經廣東新會市中醫院臨床試驗,在53例單純性骨折患者中效者23人,有效者28人。用於軟組織挫傷病人12例,顯效者8人,有效者4人,而經治療的嗯喉炎患者,每一例都達顯效,表現出良好的套用前景。

獸藥方面

,華南農業大學與廣西亞熱帶作物研究所協作,用木瓜酶、抗菌素和凡士林作膏劑,對百多例深層蹄心部化膿性外傷的奶牛進行治療,酶將嚴重阻隔藥物進入的瘡痂分解,令抗菌素直接觸及創面細菌,治癒了廣州朱村奶牛場病患達幾個月的頑固蹄腐病牛,開創了木瓜酶獸藥的先河。 作為啤酒工業套用,可在發酵初期添加木瓜酶達到降低麥芽用量。添加量一般為每噸輔料加入酶120～150g及加入a—澱粉酶1.5～2公斤。也可在後發酶結束至裝罐前加入木瓜蛋白酶,用量為酒量的百萬分之五,此時,即可獲得防止啤酒冷混濁良效。

食品方面

上還能廣泛用於以下工藝。由於木瓜酶可以水解麵粉中的蛋白而使麵粉發酵時的麵筋粘度降低,製成的餅乾會更加膨鬆酥脆,100公斤麵粉加入木瓜蛋白酶量約0.8公斤即可,而且可用活性較低的酶。

將木瓜酶配進食鹽、澱粉等做成的肉類嫩化劑可將淘汰的老家禽、家畜肉烹調時嫩化。若以木瓜酶水劑,甚至可以宰殺前用靜脈注射方法將老鵝、水牛等肉質欠佳的動物肉大大改善。美國市場上銷售的牛肉若經宰前木瓜酶處理,價格就要比不處理的高三倍以上。且一頭牛的酶用量僅需1克不足,成本之低效果之佳令人驚嘆。 在豬、雞等禽畜飼料中加入少量的木瓜蛋白酶後,飼餵時飼料中的蛋白質就更易於被消化吸收,達到省料快長的目的。一般每噸飼料加入低檔次木瓜蛋白酶約1公斤效果即很明顯。國外此法已相當普及,國內加酶飼料也逐步進入市場。

日用化工

用木瓜蛋白酶配合以多元醇作保護劑、保濕劑,製成護膚化妝品,利用該酶對死皮強烈清除分解而不傷及正常皮膚的特性,達到使用者皮膚鮮嫩柔和。若在護膚用品中加入以木瓜酶水解過的明膠、皮膠等,因為這類富含脯氨酶、羥脯氨酸的蛋白已分解到平均分子量2000以下,使小分子多肽營養能直接通過皮膚吸收,而可達養顏功能。目前這樣的護膚品早已獲女孩子青睞,連男士也開始嚮往了。

木瓜蛋白酶的用途很多,且人們還不斷在發現開發新用處新途徑,相信不久的將來,它將會更好地發揮作用造福於人,套用量也將跟著擴大。