基本介紹
- 中文名：放射性免疫分析法
- 性質：超微量分析技術等
- 突出優點：具有靈敏度高和特異性強
- 缺點：重複性差，非特異性結合率高
一、競爭性RIA，又稱傳統RIA
基本原理是根據被測定的抗原物質和其標記物（標記抗原）同特異性抗體之間存在著競爭性的結合。主要特點：標記的是抗原。其原理：未知抗原Ag+標記抗原Ag +已知定量抗體Ab標記抗原與抗體複合物AgAb+未知抗原與抗體複合物Ag Ab+游離標記抗原Ag （去除）（未知抗原多，標記抗原與定量抗體結合的複合物就少，表現為負相關）。若以Ag和Ag*分別代表待測抗原和標記抗原，Ab代表抗體，Ag·Ab和Ag*·Ab分別代表非標記的和標記的抗原抗體複合物，則當Ag與Ag*同時存在時，這一系統呈如圖所示的平衡關係：
在Ab恆定時，由於Ag的存在而使Ag*·Ab的產量減少。若F代表未結合的Ag*，B代表Ag*·Ab複合物，則B/F與Ag之量存在函式關係。若以B/F為縱坐標，Ag濃度（ng/ml）為橫坐標，則可繪製出劑量反應標準曲線。測量未知樣品時，只需在同樣條件下測量B和F的放射性，即可由標準曲線求出被測樣品的濃度，而不需純化樣品。本方法要求有高純度的標記抗原，測定標準曲線時要尋找合適的標準品，標準品的免疫活性應與待測樣品相當，且不含放射性免疫干擾物。
臨床上甲胎蛋白（AFP），癌胚抗原（CEA），8 一微球蛋白（pz—MG ），鐵蛋白（Fer），人絨毛膜促性腺激素p亞單位（HCG-13）等的檢測都是競爭性RIA法原理。競爭性RIA法，根據加樣順序與溫育次數的區別，反應方式分三種：平衡法，將非標記抗原（被測物與標準品）、抗體、標記抗原依次加入反應管，混勻後一次性溫育至反應達到動態平衡，再加分離劑分離B（複合物）與F（游離物）如：AFP，8 一MG，Fer；順序加樣法，先將非標記抗原（被測物與標準品），與抗體在反應管內作第一次溫育，待反應達到動態平衡後。加入標記抗原，再作第二次溫育後，分離B與F如：CEA；急診檢測法：為臨床急需檢測結果而提出的反應方式，不等RIA 反應達到動態平衡就終止反應；分離劑的選擇有，PEG（聚乙二醇），第二抗體等。
現在一般採用的是：第二抗體與PEG合用的方法，稱為雙抗體一PEG法。
PEG原理：PEG濃度達到7 一9 時能使抗原一抗體複合物沉澱。
優點：經濟，簡便，通用。
缺點：重複性差，非特異性結合率高。
第二抗體：第一抗體是可與被測抗原進行特異結合的抗體，來自家兔或豚鼠。用第一抗體為抗原，作用到羊，馬身上，產生的抗第一抗體的抗體稱第二抗體。第二抗體與第一抗體在適當條件下發生特異性結合，生成分子量很大的免疫複合物（AgAb ×Ab ），能自然沉澱。
優點：分離效果好。非特異性結合率低。
缺點：增加經費投入。需要第二次溫育，延長了時間。
所以就產生了兩者合用的雙抗體一PEG法，它結合了上述兩種方法的優點。
二、非競爭性RIA，又稱免疫放射分析（IRMA）
主要特點：標記的是抗體。
按反應原理分為兩種：
（一）單位點IRMA
其原理：抗原只有一個抗原決定簇，所測的抗原為小分子抗原，Ab+AgAg Ab+ Ab+ ImAd—Ag ImAd—AgAb+Ag Ab（去除）（負相關）：（ImAd—Ag）固相抗原免疫吸附劑，一般用聚苯乙烯塑膠珠包被抗原；雙位點IRMA：抗原有兩個抗原決定簇，所使用的兩種亞型抗體在與同一抗原分子結合時互不干擾ImAd—Ab+AgImAd—Ab—Ag+ AbImAd-Ab—Ag- Ab+ Ab（過剩的，游離的）：（ImAd—Ab）固相抗體免疫吸附劑，一般用聚苯乙烯塑膠珠包被抗體。
（二）雙位點IRMA，又稱雙抗體夾心法
從加樣測定順序上看，有三種方法：固相抗體先與未知抗原結合，再與標記抗體結合（正向兩步法）。然後去除游離的標記抗體，測固相抗體一抗原一標記抗體複合物的放射性計數；未知抗原先與標記抗體結合，再與同相抗體結合（反向兩步法）。然後去除游離的標記抗體，測固相抗體一抗原一標記抗體複合物的放射性計數；未知抗原與固相抗體和標記抗體同時反應（一步法，又稱同時加樣法）。然後去除游離的標記抗體，測固相抗體一抗原一標記抗體複合物的放射性計數。
這三種方法都生成夾心狀的抗體一抗原一抗體複合物，故又稱雙抗體夾心法。
糖類抗原CA50，CA125就用的是其中的第三種方法（一步法），血清中的未知抗原與固相抗體和標記抗體同時反應，生成夾心狀的抗體一抗原一抗體複合物，然後去除游離的標記抗體，測固相抗體一抗原一標記抗體複合物的放射性計數。
三、RIA法的影響因素
pH和離子強度；反應溫度，溫度一般為37℃，也有45℃，室溫，4℃ 冰櫃；反應時間，操作中的注意事項：戴手套、防護鏡等，將試劑盒從冰櫃中取出，室溫下放置30 min方可使用。
（1）編號：第一排是標準管：根據標準品濃度由低到高A，B，C，D，E，F，G……；第二排是被測樣品1，2，3，4，5，6，……。
（2）加樣要準確，移液器的使用（兩個檔位，一檔吸人，二檔排出）吸頭（一個標本一個吸頭，避免互相污染）。加試劑：先看瓶簽，再搖勻，最後吸人。（標記物一般為紅色，一抗為蘭色）。
（3）溫育時間要保證：按說明書中所要求的時間溫育，可以延長，不能縮短。
（4）分離劑加入：混勻靜置時間，可以延長，不能縮短。保證抗原抗體複合物與第二抗體的充分結合。
（5）溫度：注意觀察水浴箱的水溫，誤差不能太大，為±1℃ ，室溫21℃左右。
（6）離心時間：也應按說明書中所要求來操作，轉速一般為3 500r/min。往離心機里放反應管時，儘量讓它直立（因為傾斜可能會使液體流出）。吸上清液時，沉澱物在試管底部，真空泵的吸頭頭部不能直接插人到試管底部中央（會吸走沉澱物，而我們的目的是分離保留沉澱物），應該使吸頭貼著試管管壁往下放，並且試管要稍微傾斜，但要在即將插到沉澱物邊緣時停止，快速上升取出。少留一點點上清液也可。主要是保證沉澱物完整。
（7）進人免疫計數器測量時，注意觀察做出的曲線好壞：是不是需要修改，剔除壞點。
（8）報結果：碰到異常結果，要再次看一看沉澱物是否都在，患者情況如何，結果是否與患者情況相符，方可報出。非競爭性RIA法中，清洗固相包被珠時，清洗次數要嚴格按說明書中所要求來操作，不得減少。
雖然RIA法的影響因素很多，但操作中只要注意上述事項，RIA法的穩定性還是相當不錯的。主要是它存在放射污染，這個問題不易解決，影響了它以後的發展，如今電化學發光免疫分析，化學發光免疫分析，酶聯免疫分析，磁酶免疫分析等相繼推出，發展很快，RIA法將被淘汰。
參考文獻：
（1）程紹鈞，餘裕民.檢驗核醫學[M]。重慶：重慶大學出版社，2003，62—75。
