掃描電子顯微鏡樣品製備技術（preparationof specimens for scanning electron microscopy）：掃描電子顯微鏡以觀察樣品的表面形態為主，因此掃描電子顯微鏡樣品的製備，必須滿足以下要求：①保持完好的組織和細胞形態；③充分暴露要觀察的部位；③良好的導電性和較高的二次電子產額；④保持充分乾燥的狀態。
基本介紹
- 中文名：掃描電子顯微鏡樣品製備技術
- 外文名：preparationof specimens for scanning electron microscopy
- 製備方法：清洗、化學固定、乾燥、噴鍍金屬
- 用途：觀察樣品的表面形態
- 出現時間：20世紀80年
- 樣品要求：保持完好的組織和細胞形態
概述,化學方法製備樣品,清洗,固定,乾燥,噴鍍金屬,冷凍方法製備樣品,冷凍固定,冷凍乾燥,冷凍割斷,
概述
某些含水量低且不易變形的生物材料，可以不經固定和乾燥而在較低加速電壓下直接觀察，如動物毛髮、昆蟲、植物種子、花粉等，但圖象質量差，而且觀察和拍攝照片時須儘可能迅速。對大多數的生物材料，則應首先採用化學或物理方法固定、脫水和乾燥，然後噴鍍碳與金屬以提高材料的導電性和二次電子產額。
化學方法製備樣品
化學方法製備樣品的程式通常是：清洗→化學固定→乾燥→噴鍍金屬。
清洗
某些生物材料表面常附血液、細胞碎片、消化道內的食物殘渣、細菌、淋巴液及粘液等異物，掩蓋著要觀察的部位，因而，需要在固定之前用生理鹽水或等滲緩衝液等把附著物清洗乾淨。亦可用5%碳酸鈉沖洗或酶消化法去除這些異物。
固定
通常採用醛類（主要是戊二醛和多聚甲醛）與四氧化鋨雙固定，也可用四氧化鋨單固定。四氧化鋨固定不僅可良好地保存組織細胞結構，而且能增加材料的導電性和二次電子產額，提高掃描電子顯微圖象的質量。這對高分辨掃描電子顯微術是極端重要的。為增強這種效果，可用四氧化鋨-單寧酸或是四氧化鋨-珠叉二胼等反覆處理材料，使其結合更多的重金屬鋨，這就是導電染色。
乾燥
固定後通常採用臨界點乾燥法。其原理是：適當選擇溫度和壓力，使液體達到臨界狀態（液態和氣相間界面消失），從而避免在乾燥過程中由水的表面張力所造成的樣品變形。對含水生物材料直接進行臨界點乾燥時，水的臨界溫度和壓力不能過高（37.4℃，218帕）。通常用乙醇或丙酮等使材料脫水，再用一種中間介質，如醋酸戊酯，置換脫水劑，然後在臨界點乾燥器中用液體或固體二氧化碳、氟利昂13以及一氧化二氮等置換劑置換中間介質，進行臨界乾燥。
噴鍍金屬
將乾燥的樣品用導電性好的粘合劑或其他粘合劑粘在金屬樣品台上，然後放在真空蒸發器中噴鍍一層50～300埃厚的金屬膜，以提高樣品的導電性和二次電子產額，改善圖象質量，並且防止樣品受熱和輻射損傷。如果採用離子濺射鍍膜機噴鍍金屬，可獲得均勻的細顆粒薄金屬鍍層，提高掃描電子圖象的質量。
冷凍方法製備樣品
低溫掃描電子顯微術是20世紀80年代迅速發展和廣泛套用的方法。它包括生物樣品的冷凍固定、冷凍乾燥、冷凍割斷和冷凍含水樣品的掃描電子顯微術等。
冷凍固定
將生物材料投入低溫的致冷劑中，如液氦、液氮、液體氟利昂及丙烷等。快速冷凍可使生物組織細胞的結構和化學組成接近於生活狀態。被冷凍固定的生物樣品，可以在低溫條件下轉移到具有低溫樣品台的掃描電子顯微鏡中直接觀察無需進一步處理或僅在冷凍樣品表面噴鍍一薄層金屬。這種方法不僅快速簡便，而且可以排除由於乾燥法造成收縮的假象，特別適合於研究含水量很高的生物材料。
冷凍乾燥
生物樣品經冷凍固定後，其中的水分凍結成冰，表面張力消失；再將冷凍樣品放於真空中，使冰漸漸升華為水蒸氣。這樣獲得的乾燥樣品在一定程度上避免了表面張力造成的形態改變。由於水冷凍而形成的冰晶會破壞組織結構，冰在真空中升華速度很慢，同時需要大型複雜的冷凍乾燥裝置，所以冷凍乾燥法沒有臨界乾燥法套用廣泛。如果在冷凍前用有機溶劑置換樣品中的水，而後，冷凍乾燥，則可消除冰晶對結構的破壞，並大大縮短乾燥時間；也無需特殊裝置。
冷凍割斷
為了觀察臟器或細胞內部結構，可切斷冷凍樣品，再經化學固定、導電染色、脫水和臨界點乾燥及噴鍍金屬，用掃描電鏡觀察割斷表面暴露出的內部結構。冷凍割斷又包括乙醇割斷法、二甲基亞碸割斷法及冷凍斷裂法等多種。用冷凍割斷法可獲得高分辨的組織細胞內部三維構造的掃描電子顯微鏡圖象。
