抑菌圈法又叫擴散法，是利用待測藥物在瓊脂平板中擴散使其周圍的細菌生長受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，根據抑菌圈大小判定待測藥物抑菌效價的一種方法。抑菌圈法操作便捷、簡單易行、成本低廉、結果準確可靠，是抑菌試驗的經典方法，被廣泛使用。常用於抗生素產生菌的分離篩選。工具菌採用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制工具菌生長的物質，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，很容易被鑑別出來。
基本介紹
- 中文名：抑菌圈法
- 外文名：inhibition zone method
- 用途：抑菌試驗
- 分類：濾紙片法、牛津杯法和打孔法
目前抑菌圈研究法中使用最多的主要有K-B法（Kirby-Bauer test）、牛津杯法和打孔法三種。K-B法即濾紙片法，選用質地均勻的濾紙，用打孔機打成直徑相同的圓片，滅菌後烘乾，浸泡於待測樣品中，然後置於試驗平板中培養一段時間後測定抑菌圈大小的一種方法。牛津杯法又稱杯碟法，將已滅菌的牛津杯置於試驗平板中，往杯中注入一定量的待測樣品，培養一段時間後測定抑菌圈大小的一種方法。打孔法，是指用已滅菌的打孔器或鋼管在試驗平板上打孔，往孔中注入一定量的待測樣品，培養一段時間後測定抑菌圈大小的一種方法。
1、主要器皿及用品
培養皿（直徑90 mm）、打孔器（孔徑6 mm）、牛津杯（內徑6 mm）、不鏽鋼圓管（外徑6 mm）、濾紙、三角瓶（250 mL）。
培養皿（直徑90 mm）、打孔器（孔徑6 mm）、牛津杯（內徑6 mm）、不鏽鋼圓管（外徑6 mm）、濾紙、三角瓶（250 mL）。
2、培養基
液體培養基：蛋白腖10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl10 g/L，pH 7.8。
平板培養基：蛋白腖10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.8。
3、 方法
菌種的活化及菌液的製備：將冷凍保存的菌種劃線接種至平板培養基，37℃培養24 h；挑單菌落接種至100 mL液體培養基，37℃、200 r/min搖床培養過夜，菌液備用。
試驗平板的製備：
液體培養基：蛋白腖10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl10 g/L，pH 7.8。
平板培養基：蛋白腖10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.8。
3、 方法
菌種的活化及菌液的製備：將冷凍保存的菌種劃線接種至平板培養基，37℃培養24 h；挑單菌落接種至100 mL液體培養基，37℃、200 r/min搖床培養過夜，菌液備用。
試驗平板的製備：
塗布平板法：先往已滅菌的平板中傾注20 mL左右平板培養基，水平靜置凝固，接種0.1 mL菌液，塗布均勻後備用。
傾注平板法：先往已滅菌的平板中接種1 mL菌液，然後傾注約20 mL已冷卻至50 ℃左右的平板培養基，混合均勻，水平靜置凝固後備用。
預加菌液傾注平板法：往已冷卻至50 ℃左右的平板培養基中注入一定量的菌液，混合均勻，傾注平板（約20 mL/平板），水平靜置凝固後備用。
傾注平板法：先往已滅菌的平板中接種1 mL菌液，然後傾注約20 mL已冷卻至50 ℃左右的平板培養基，混合均勻，水平靜置凝固後備用。
預加菌液傾注平板法：往已冷卻至50 ℃左右的平板培養基中注入一定量的菌液，混合均勻，傾注平板（約20 mL/平板），水平靜置凝固後備用。
目前流行的試驗平板製備方法主要有3個：①塗布平板法、②傾注平板和③預加菌液傾注平板法。
方法①獲得的試驗平板其抑菌圈清晰，但菌體生長不夠均勻，重複性較差，效果一般；方法②和方法③獲得的試驗平板其抑菌圈清晰，菌體生長均勻，重複性好，效果好。綜合試驗過程的各步驟細節，方法①導致菌體生長不均勻的原因可能是塗布操作不能很好地保證菌液平均分布於平板的各個角落，且重複性不夠好；方法②和方法③的效果均較好，但方法③獲得的試驗平板質量會更高，原因是在製備平板前把菌液加進培養基中，搖均勻後再傾注平板，保證了每個平板中菌的濃度是一樣的，這一點是方法②無法做到的，從而保證了試驗的一致性。
方法①獲得的試驗平板其抑菌圈清晰，但菌體生長不夠均勻，重複性較差，效果一般；方法②和方法③獲得的試驗平板其抑菌圈清晰，菌體生長均勻，重複性好，效果好。綜合試驗過程的各步驟細節，方法①導致菌體生長不均勻的原因可能是塗布操作不能很好地保證菌液平均分布於平板的各個角落，且重複性不夠好；方法②和方法③的效果均較好，但方法③獲得的試驗平板質量會更高，原因是在製備平板前把菌液加進培養基中，搖均勻後再傾注平板，保證了每個平板中菌的濃度是一樣的，這一點是方法②無法做到的，從而保證了試驗的一致性。
當抑菌劑含量一定時，抑菌圈的大小跟菌體濃度有很大關係，如果菌體濃度過大，會拮抗抑菌劑的作用，導致抑菌圈偏小。因此，對試驗平板中的菌體數進行梯度濃度試驗，可確定實驗最適合的活菌濃度。
對比抑菌圈的K-B法、牛津杯法和打孔法，結果表明：（1）打孔法操作簡單、方便快捷，獲得的抑菌圈質量高、重複性好，是優先選用的方法；（2）牛津杯法獲得的抑菌圈質量較高，重複性較好，但在放置牛津杯、加注藥品的時候要小心，以免藥物滲漏，將試驗平板移動至培養箱的過程中要避免牛津杯的打翻；（3）K-B法操作簡單、方便快捷，獲得的抑菌圈質量較高，但重複性不佳，不適宜進行定量試驗，只適宜進行定性試驗。
3種方法獲得的抑菌圈其形狀均比較理想，抑菌圈直徑大小分別是：K-B法16.84 mm、牛津杯法18.36 mm、打孔法22.58 mm。對於K-B法，其操作簡單、方便快捷，被研究者廣泛利用，但由於浸泡藥品時很難控制藥品在濾紙片上的吸附量且重複性較差，因此不適宜於定量試驗，只適合於定性試驗。對於牛津杯法，其是國內外測定抗生素效價的通用方法，通過試驗，獲得的抑菌圈質量較高，重複性較好；其不足是放置牛津杯時，很難掌握力度以保證每個牛津杯與試驗平板接觸情況的一致性，而且加完樣品然後轉移至培養箱的過程當中，由於試驗人員的不小心或其它原因，會導致牛津杯的移動或鬆動甚至倒翻，對試驗結果造成很大的影響。對於打孔法，此次試驗結果獲得的抑菌圈質量高、重複性好，抑菌圈直徑是最大，其基本能解決K-B法和牛津杯法中不足的地方，且其操作簡單方便，越來越受試驗人員青睞；需要注意的是打完孔後挑去孔中培養基小塊的時候，一定要小心操作，如果用力不當，會破壞孔的完整性，導致抑菌圈形狀不規則。
另外，在測量抑菌圈直徑大小的時候，這3種方法當中，打孔法的誤差最小，原因是K-B法和牛津杯法的試驗平板中，由於藥物是從培養基表面向四周呈球形擴散（如圖7所示），培養基越厚，培養基表面與底部的濃度差越明顯，造成表面和底部所形成的抑菌圈直徑大小不一樣，對試驗人員的測量工作造成一定的影響；而打孔法的藥物是直接向四周的培養基均勻擴散（如圖7所示），培養基表面和底部的抑菌圈大小保持一致，避免了前兩種方法中由於試驗人員人為的觀察差異而導致測量誤差。
在進行抑菌圈法試驗時，還應考慮以下幾點：一是試驗平板的製備，經過試驗，預加菌液傾注平板法的效果最好，相對傾注平板法和塗布平板法而言，能有效保證試驗平板中菌落的均勻性、均一性，且重複性好。二是應考慮試驗平板中菌落的濃度，試驗結果顯示，試驗平板中菌體濃度在1×10^5~1×10^6 CFU/mL時，平板菌落濃度緻密，抑菌圈界限明顯，是進行抑菌圈試驗的適合菌體濃度。三是加入試驗藥物後應進行預擴散，試驗結果顯示，在4 ℃條件下預擴散2 h左右比較適合。四是抑菌藥物應選擇適宜的濃度，其濃度應使抑菌圈直徑在18~22 mm，過小會增加測量的誤差，過大的話，如果在一個試驗平板中用多個孔（或多個牛津杯）進行多濃度試驗時，會造成抑菌圈交叉，影響試驗結果。五是應考慮培養基的pH，因為有些抑菌藥物在偏酸性和在偏鹼性的條件下，其抑菌效果差異較大；另外不同的pH對微生物的生長影響是有差異的；再有就是在弱鹼性條件下，培養基硬度較
好，有利於打孔法中培養基小塊的挑出。
好，有利於打孔法中培養基小塊的挑出。
