《微生物抗干擾快速檢測方法》是廣東省微生物研究所和廣州環凱生物技術有限公司於2004年4月8日申請的發明專利，該專利的申請號為2004100267945，公布號為CN1680804，公布日為2005月10月12日，發明人是吳清平、張菊梅、吳慧清、郭偉鵬。
《微生物抗干擾快速檢測方法》首先根據樣品含干擾物質的類別和檢測項目的不同選用抗干擾或普通微生物培養基對樣品進行液體大樣法或最近似數（MPN）法增菌；然後用細胞ATP釋放劑Ec對樣品進行處理，再加入適量的解抑劑和螢光素酶－螢光素試劑後進行ATP發光檢測。如樣品發光脈衝計數CPM樣＞對照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽性，查MPN表，可得樣品含菌量。該發明縮短檢測時間，一般只需常規培養檢測時間的1/3～1/4，同時解決了樣品中存在的一些防腐劑或殘留消毒劑的干擾問題，大幅度提高檢測靈敏度，其中生物發光液體大樣法可達到10cells/100毫升，生物發光最近似數（MPN）法可達到30cells/100毫升，比普通生物發光法檢測靈敏度最少提高1000倍。
2014年11月6日，《微生物抗干擾快速檢測方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：微生物抗干擾快速檢測方法及試劑
- 公布號：CN1680804
- 公布日：2005月10月12日
- 申請號：2004100267945
- 申請日：2004年4月8日
- 申請人：廣東省微生物研究所、廣州環凱生物技術有限公司
- 地址：廣東省廣州市先烈中路100號
- 發明人：吳清平、張菊梅、吳慧清、郭偉鵬
- 分類號：G01N21/76；C12N1/20
- 代理機構：廣州弘邦專利商標事務所有限公司
- 類別：發明專利
- 代理人：張釔斌、郭澄聯
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
2004年4月前，作為微生物最大宗的常規檢測項目——細菌、黴菌和酵母菌數量的檢測，依然沿用一百多年前由巴斯德建立的瓊脂平板計數法。傳統的微生物檢測方法依賴於特殊的微生物培養基來分離培養樣品中存活的微生物，這些方法靈敏、直觀，能同時提供食品中微生物數量和種類的信息。然而常規方法從開始培養到肉眼可見的菌落需要1～5天時間，且操作繁瑣，局限於實驗室，對操作人員的技術水平要求高，容易出現人為的誤差；而迄今為止作為自然環境中的微生物，能夠進行人工培養的一般認為只有5～10％，沒有單獨一種培養基或一套物理、化學條件能夠滿足樣品中所有微生物的生理要求；同時，培養基的製備、平板培養、菌落計數和生化鑑定工作量大、費時、費力，提供的是歷史性信息，不能達到企業生產質量控制、衛生監督檢測快速獲得微生物信息的要求。近年來，隨著科技的進步和自動化技術的套用，傳統方法在樣品處理、平板培養、菌落計數和鑑定系統上所做的許多改進，已使操作更加簡易和方便，同時亦降低了花費和減少了工作量。但居於培養的方法仍需以時間為代價，無法快速得到結果，遠遠不能滿足食品工業生產、環境衛生監督現場檢測的需求。因此，微生物快速檢測的技術和儀器便順勢而生，其中ATP生物發光線上微生物快速檢測方法是2004年4月前認為最有可能實現微生物數量線上檢測的新技術。
ATP生物發光技術於20世紀60年代由NASA（美國航空航天局）的科學家們（Chappelle和Levin等）提出，其原理是螢火蟲螢光素酶（Luciferase）以螢光素（D-Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2為底物，在Mg存在時，能將化學能轉化為光能。反應式表示為：
ATP既是螢光素酶催化發光的必需底物，又是所有生物生命活動的能量來源，在螢光素酶催化的發光反應中，ATP在一定的濃度範圍內，其濃度與發光強度呈線形關係。D’Eustachio和Levin的研究表明，各生長時期的細菌均有較恆定水平的ATP含量，因此，提取細菌的ATP，利用生物發光法測出ATP的含量後即可推算出樣品中的含菌量，整個過程僅為十幾分鐘。由於生物發光法無需培養過程，操作簡便，靈敏度高，數分鐘內可得到結果，Sharpe等（1970）首先套用該法檢測食品中存在的微生物，但高水平的非微生物細胞ATP降低了靈敏度。儘管如此，許多科研人員依然對該法用來評估食品中的微生物污染具有濃厚的興趣，並為此作出了很大的努力。一直到20世紀90年代早期，ATP生物發光技術才真正套用到食品工業的衛生質量控制（Giffiths，1993，1995；Kyriakides和Patel，1994）和環境監測。最成功的套用是生產開始前生產線和環境的衛生狀況檢測，該法可在2分鐘內得到設備表面清潔狀況的檢測結果，具有其它微生物檢測方法無法比擬的優勢。同時，ATP生物發光法還套用到原材料、終產品的微生物檢測。Bautista、Joao Niza-Ribeiro等套用ATP生物發光法分別檢測禽肉、粗乳中的微生物含量，在數分鐘內得到結果以判斷微生物的污染狀況，他們認為該法與平板計數法相比快速、可靠、準確。Russell、Sinell等認為ATP生物發光法是唯一適合HACCP的衛生監測方法，是執行HACCP的基礎，同時也是2004年4月前檢測微生物最快的方法。中國國外一些公司根據生物發光的原理研製出成套的生物發光檢測裝置和試劑盒用於微生物數量快速測定，該檢測系統由生物發光檢測儀和測定試劑盒兩大部分組成，其微生物數量的檢測限一般為細菌10cells/毫升，最高的靈敏度也只達到10cells/毫升，微生物含量在10cells/毫升以上的樣品可在十幾分鐘內迅速檢測出結果。迄今許多國家已將ATP生物發光法作為食品工業生產和環境衛生監督現場檢測的有效手段，而中國國內尚處於起步階段。
與食品工業生產和環境衛生監督一樣，食品飲料產品的微生物檢測同樣是生物發光法的重要套用對象，但ATP生物發光法在這方面存在嚴重缺陷，因為該法要求樣品中細菌濃度最低不少於10cells/毫升，這種靈敏度經常達不到衛生學的要求。當樣品帶菌量小於100cells/毫升，甚至小於1cell/毫升時，直接使用生物發光法微生物快速檢測技術則不能有效地檢出其中的含菌量。同時，樣品中存在的微生物為休眠狀態的芽孢或孢子時，ATP含量極低，達不到發光檢測的靈敏度。另外，在食品工業等生產過程中，廣泛的使用著防腐劑和消毒劑，樣品中微生物受到防腐劑和消毒劑的影響，處於抑制或受傷狀態，ATP含量亦極低，同樣達不到發光檢測的要求。因此，ATP生物發光法雖然靈敏、快速，但由於上述不足之處使它的套用受到了很大的限制。
發明內容
專利目的
《微生物抗干擾快速檢測方法》的目的在於克服2004年4月前ATP生物發光法存在的靈敏度不足的問題，解決樣品中存在的一些防腐劑或殘留消毒劑的干擾問題，提供一種增加靈敏度、抗干擾的微生物快速檢測方法及試劑，提高檢測的靈敏度和縮短檢測所需的時間。
技術方案
《微生物抗干擾快速檢測方法》由兩部分組成，一是用抗干擾微生物培養基對有防腐劑或消毒劑等干擾物質的樣品進行液體大樣法或最近似數（MPN）法增菌，使受損傷的微生物復甦或休眠狀態的芽孢、孢子萌發；二是用細胞ATP釋放劑Ec對樣品進行處理，釋放出樣品中的微生物細胞ATP，然後進行發光檢測。
該發明可縮短檢測時間，細菌6小時內可完成檢測，酵母12小時內完成檢測，黴菌24小時內完成檢測，同時大幅度提高檢測靈敏度，其中生物發光液體大樣法可達到10cells/100毫升，生物發光最近似數（MPN）法可達到30cells/100毫升，比生物發光法的檢測靈敏度最少提高1000倍。
該發明的微生物數量快速檢測方法的具體操作方法：
1）抗干擾細菌和真菌液體大樣法及MPN法快速測定
（1）抗干擾細菌和真菌液體大樣法快速測定
該方法適於含有防腐劑、消毒劑等干擾物質的樣品的無菌度檢測，按照樣品含干擾物質的類別和檢測項目的不同，分別選擇抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型細菌或真菌液體培養基：
a.培養基的配製：參照抗干擾細菌和真菌液體培養基說明配製50毫升/瓶三料液體培養基，分裝到250毫升三角瓶中，並準備其它配套用品，滅菌備用；
b.微生物的培養：在超淨工作檯中，將已混合併分散好的100毫升（克）樣品加入到裝有冷卻後的50毫升/瓶三料培養基的250毫升三角瓶中，搖勻混合後細菌在35-37℃下培養3～6小時，真菌在30-32℃下培養10～24小時；
c.微生物細胞ATP提取方法：分別取10毫升培養液，於10000轉/分鐘離心5分鐘，去上清液，沉澱加入1毫升微生物細胞ATP釋放劑Ec，作用1～5分鐘；
d.ATP生物發光測定方法：吸取0.1毫升樣品ATP提取液於發光管中，加入適量解抑劑和25毫摩爾/升Tricine緩衝液，使體積為0.9毫升，再加入0.1毫升螢光素酶-螢光素試劑，立刻搖勻，置於25℃生物發光檢測儀中進行發光脈衝計數；
e.作標準ATP檢測和培養基與樣品混合不作培養的對照樣液檢測；
f.結果判定：當樣品發光脈衝計數CPM樣＞對照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽性。
（2）抗干擾細菌和真菌MPN法快速測定
要確定含有防腐劑、消毒劑等干擾物質的低菌數樣品的微生物數量，可採用最近似數法（MPN法）對樣品進行檢測。按照樣品含干擾物質的類別和檢測項目的不同，分別選擇抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型細菌或真菌液體培養基：
a.培養基的配製：按國標大腸菌群數量多管發酵法配製抗干擾細菌和真菌液體培養基（無需在試管中加入小倒管），並準備其它配套用品，滅菌備用；
b.微生物的培養：在超淨工作檯中，將已混合併分散好的樣品按國標大腸菌群數量多管發酵法加入到測定系統中，搖勻混合後細菌在35-37℃下培養3～6小時，真菌在30-32℃下培養10～24小時；
c.微生物細胞ATP提取方法：各管培養液，於10000轉/分鐘離心5分鐘，去上清液，沉澱加入1毫升微生物細胞ATP釋放劑Ec，作用1～5分鐘；
d.ATP生物發光測定方法：吸取0.1毫升樣品ATP提取液於發光管中，加入適量解抑劑和25毫摩爾/升Tricine緩衝液，使體積為0.9毫升，再加入0.1毫升螢光素酶-螢光素試劑，立刻搖勻，置於25℃生物發光檢測儀中進行發光脈衝計數；
e.作標準ATP檢測和培養基與樣品混合不作培養的對照樣液檢測；
f.結果表示：當樣品發光脈衝計數CPM樣＞對照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽性，記錄樣品陽性管數，查MPN表，即得結果。
2）普通細菌和真菌液體大樣法及MPN法快速測定
（1）普通細菌和真菌液體大樣法快速測定
該方法適於不含防腐劑、消毒劑等干擾物質的樣品的無菌度檢測。
A.培養基的配製：參照普通細菌和真菌液體培養基說明配製50毫升/瓶三料液體培養基，分裝到250毫升三角瓶中，並準備其它配套用品，然後滅菌；
B.微生物的培養：在100級超淨工作檯中，將已混合併分散好的100毫升（克）樣品加入到裝有冷卻後的50毫升/瓶三料培養基的250毫升三角瓶中，搖勻混合後細菌在35-37℃下培養3～6小時，真菌在30-32℃下培養10～24小時；
C.微生物細胞ATP提取方法：分別取10毫升培養液，於10000轉/分鐘離心5分鐘，去上清液，沉澱加入1毫升微生物細胞ATP釋放劑Ec，作用1～5分鐘；
D.ATP生物發光測定方法：吸取0.1毫升樣品ATP提取液於發光管中，加入適量解抑劑和25毫摩爾/升Tricine緩衝液，使體積為0.9毫升，再加入0.1毫升螢光素酶-螢光素試劑，立刻搖勻，置於25℃生物發光檢測儀中進行發光脈衝計數；
同時作標準ATP檢測和培養基與樣品混合不作培養的對照樣液檢測；
E.結果判定：當樣品發光脈衝計數CPM樣＞對照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽性。
（2）最近似數法（MPN法）快速測定
要確定低菌數樣品的微生物數量，可採用最近似數法（MPN法），對樣品進行檢測。
A.培養基的配製：按國標大腸菌群數量多管發酵法配製普通細菌和真菌液體培養基（無需在試管中加入小倒管），並準備其它配套用品，然後滅菌；
B.微生物的培養：在超淨工作檯中，將已混合併分散好的樣品按國標大腸菌群數量多管發酵法加入到測定系統中，搖勻混合後細菌在35-37℃下培養3～6小時，真菌在30-32℃下培養10～24小時；
C.微生物細胞ATP提取方法：各管培養液，於10000轉/分鐘離心5分鐘，去上清液，沉澱加入1毫升微生物細胞ATP釋放劑Ec，作用1～5分鐘；
D.ATP生物發光測定方法：吸取0.1毫升樣品ATP提取液於發光管中，加入適量解抑劑和25毫摩爾/升Tricine緩衝液，使體積為0.9毫升，再加入0.1毫升螢光素酶-螢光素試劑，立刻搖勻，置於25℃生物發光檢測儀中進行發光脈衝計數；
同時作標準ATP檢測和培養基與樣品混合不作培養的對照樣液檢測；
E.結果表示：當樣品發光脈衝計數CPM樣＞對照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽性；記錄樣品陽性管數，查MPN表，即得結果。
該發明中，對樣品通過抗干擾細菌、真菌液體培養基或普通細菌、真菌液體培養基進行預培養，增加生物發光檢測靈敏度。
該發明所提及的用於增菌的液體培養基為具有抵抗防腐劑、消毒劑、臭氧干擾性能的細菌及真菌液體培養基、普通細菌或真菌培養用的營養肉湯培養基及黴菌培養基等八種培養基，均由廣東省微生物研究所屬下廣東環凱微生物科技有限公司生產，在該公司均可購得，其使用濃度見下表1：
使用的培養基 | 濃度（克/升） |
營養肉湯培養基 | 22-24 |
抗防腐劑型細菌液體大樣檢測培養基 | 22-28 |
抗消毒劑型細菌液體大樣檢測培養基 | 20-24 |
抗臭氧型細菌液體大樣檢測培養基 | 19-23 |
黴菌液體培養基 | 14-18 |
抗防腐劑型真菌液體大樣檢測培養基 | 21-25 |
抗消毒劑型真菌液體大樣檢測培養基 | 17-21 |
抗臭氧型真菌液體大樣檢測培養基 | 16-20 |
抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型液體大樣檢測培養基可分別消除防腐劑山梨酸及山梨酸鉀、苯甲酸及苯甲酸鈉，消毒劑二氧化氯、過氧乙酸、次氯酸鈉及過氧化氫和臭氧及余氯的干擾（表2），在檢測含有干擾物質的樣品時，與普通液體培養基相比，可提高檢測的靈敏度。
培養基名稱 | 可以消除的干擾物質 | 可以消除的干擾物質的濃度 |
抗防腐劑型液體大樣檢測培養基 | 苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀 | 2.0克/升（千克） |
抗消毒劑型液休大樣檢測培養基 | 二氧化氯 | 150毫克/升 |
過氧乙酸 | 400毫克/升 | |
次氯酸鈉 | 700毫克/升 | |
過氧化氫 | 180毫克/升 | |
抗臭氧劑型液體大樣檢測培養基 | 臭氧、余氯 | 10.0毫克/升 |
該發明所提及的微生物細胞ATP釋放劑Ec含有：1～30克/升TritonX-100；0.1～5.0克/升十六烷三甲基溴化銨（CTAB）；0.1～3.0克/升二甲亞碸（DMSO）；0.01～0.1克/升乙二胺四乙酸（EDTA）；0.01～0.1克/升硫酸鎂（MgSO4）。
製作過程為：每升無菌超純水中加入1～30克TritonX-100、0.1～5.0克CTAB、0.1～3.0克DMSO、0.01～0.1克EDTA、0.01～0.1克MgSO4，加熱使其溶解，振勻即成，所有試劑採用分析純，可在室溫條件下1～5分鐘內完成微生物細胞ATP的提取，簡便、快速。
該發明所提及的樣品處理解抑劑為內含葡萄糖單元分別為6、7、8的環糊精等環狀化合物，具體製作過程為：取0.1～15.0克分析純環糊精溶解於pH7.8Tricine緩衝液（內含50毫摩爾/升Tricine、10毫摩爾/升MgSO4、1毫摩爾/升EDTA、1毫摩爾/升DTT）中，使終體積為1000毫升，0.22微米濾膜過濾除菌後分裝至5個滅菌的小瓶，於4℃冰櫃儲存備用。該解抑劑可以排除陽離子、陰離子和兩性離子表面活性劑等物質對分析的干擾。
權利要求
1、《微生物抗干擾快速檢測方法》首先根據樣品含干擾物質的類別和檢測項目的不同選用抗干擾或普通微生物培養基對樣品進行液體大樣法或最近似數（MPN）方法增菌；然後用細胞ATP釋放劑Ec對樣品進行處理，再加入適量的解抑劑和螢光素酶-螢光素試劑後利用發光檢測儀進行發光脈衝計數；
其中，對樣品進行液體大樣法按下述步驟進行：
a.培養基的配製：按照樣品含干擾物質的類別和檢測項目的不同，分別選擇抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型細菌或真菌液體培養基；對不含有防腐劑、消毒劑等干擾物質的樣品根據檢測項目的不同選擇普通細菌或真菌液體培養基；測黴菌時則選用黴菌液體培養基；按說明配製50毫升/瓶三料液體培養基，分裝到250毫升三角瓶中，並準備其它配套用品，滅菌備用；
b.微生物的培養：在超淨工作檯中，將已混合併分散好的100毫升（克）樣品加入到裝有冷卻後的50毫升/瓶三料培養基的250毫升三角瓶中，搖勻混合後細菌在35-37℃下培養3～6小時，真菌在30-32℃下培養10～24小時；
c.微生物細胞ATP提取方法：分別取10毫升培養液，於10000轉/分鐘離心5分鐘，去上清液，沉澱加入1毫升微生物細胞ATP釋放劑Ec，作用1～5分鐘；
d.ATP生物發光測定方法：吸取0.1毫升樣品ATP提取液於發光管中，加入適量解抑劑和25毫摩爾/升Tricine緩衝液，使體積為0.9毫升，再加入0.1毫升螢光素酶-螢光素試劑，立刻搖勻，置於生物發光檢測儀中進行發光脈衝計數；
e.作標準ATP檢測和培養基與樣品混合不作培養的對照樣液的發光檢測；
f.結果判定：當樣品發光脈衝計數CPM樣＞對照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽性。
對樣品進行MPN法增菌按下述步驟進行：
a.培養基的配製：按照樣品含干擾物質的類別和檢測項目的不同，分別選擇抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型細菌或真菌液體培養基；對不含有防腐劑、消毒劑等干擾物質的樣品根據檢測項目的不同選擇普通細菌或真菌液體培養基；測黴菌時則選用黴菌液體培養基；按國標大腸菌群數量多管發酵法配製液體培養基（無需在試管中加入小倒管），並準備其它配套用品，滅菌備用；
b.微生物的培養：在超淨工作檯中，將已混合併分散好的樣品按國標大腸菌群數量多管發酵法加入到測定系統中，搖勻混合後細菌在35-37℃下培養3～6小時，真菌在30-32℃下培養10～24小時；
c.微生物細胞ATP提取方法：各管培養液，於10000轉/分鐘離心5分鐘，去上清液，沉澱加入1毫升微生物細胞ATP釋放劑Ec，作用1～5分鐘；
d.ATP生物發光測定方法：吸取0.1毫升樣品ATP提取液於發光管中，加入適量解抑劑和25毫摩爾/升Tricine緩衝液，使體積為0.9毫升，再加入0.1毫升螢光素酶-螢光素試劑，立刻搖勻，置於生物發光檢測儀中進行發光脈衝計數，同時作標準ATP檢測和培養基與樣品混合不作培養的對照樣液的發光檢測；
e.結果表示：當樣品發光脈衝計數CPM樣＞對照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽性；記錄樣品陽性管數，查MPN表，得樣品含菌量。
其特徵在於ATP釋放劑Ec內含：1～30克/升TritonX-100；0.1～5.0克/升十六烷三甲基溴化銨（CTAB）；0.1～3.0克/升二甲亞碸（DMSO）；0.01～0.1克/升乙二胺四乙酸（EDTA）；0.01～0.1克/升硫酸鎂（MgSO4）。
2、權利要求1所述的檢測方法，ATP釋放劑Ec的製作過程為：每升無菌超純水中加入1～30克TritonX-100、0.1～5.0克CTAB、0.1～3.0克DMSO、0.01～0.1克EDTA、0.01～0.1克MgSO4，加熱使其溶解，振勻即成。
3、權利要求1或2所述的檢測方法，解抑劑含有葡萄糖單元分別為6、7、8的環糊精等環狀化合物。
4、權利要求3所述的檢測方法，解抑劑的製作過程為：取0.1～15.0克環糊精溶解於pH7.8Tricine緩衝液中使終體積為1000毫升，其中緩衝液內含50毫摩爾/升Tricine、10毫摩爾/升MgSO4、1毫摩爾/升乙二胺四乙酸、1毫摩爾/升二硫蘇糖醇。
5、權利要求1所述的檢測方法，普通細菌或真菌液體培養基為營養肉湯培養基，使用濃度為：22-24克/升；抗防腐劑型細菌培養基的使用濃度為：22-28克/升；抗消毒劑型細菌培養基的使用濃度為：20-24克/升；抗臭氧型細菌培養基的使用濃度為：19-23克/升；黴菌液體培養基的使用濃度為：14-18克/升；抗防腐劑型真菌培養基使用濃度為：21-25克/升；抗防腐劑型真菌培養基使用濃度為：17-21克/升；抗臭氧型真菌培養基使用濃度為：16-20克/升。
6、權利要求2所述的檢測方法，普通細菌或真菌液體培養基為營養肉湯培養基，使用濃度為：22-24克/升；抗防腐劑型細菌培養基的使用濃度為：22-28克/升；抗消毒劑型細菌培養基的使用濃度為：20-24克/升；抗臭氧型細菌培養基的使用濃度為：19-23克/升；黴菌液體培養基的使用濃度為：14-18克/升；抗防腐劑型真菌培養基使用濃度為：21-25克/升；抗消毒劑型真菌培養基使用濃度為：17-21克/升；抗臭氧型真菌培養基使用濃度為：16-20克/升。
實施方式
實施例1：瓶裝飲用天然礦泉水中細菌液體大樣快速測定
因瓶裝飲用天然礦泉水通常用臭氧進行消毒處理，因此選用抗臭氧型細菌液體大樣檢測培養基：
a.培養基的配製：參照抗臭氧型細菌液體大樣檢測培養基說明配製50毫升/瓶三料液體培養基，分裝到250毫升三角瓶中，並準備其它配套用品，然後滅菌；
b.微生物的培養：在100級超淨工作檯中，將100毫升待檢樣品加入到裝有冷卻後的50毫升/瓶三料培養基的250毫升三角瓶中，搖勻混合後在35-37℃下培養6小時；
c.微生物細胞ATP提取方法：取10毫升培養液，於10000轉/分鐘離心5分鐘，去上清液，沉澱加入1毫升微生物細胞ATP釋放劑Ec，作用1～5分鐘；
d.ATP生物發光測定方法：吸取0.1毫升樣品ATP提取液於發光管中，加入適量解抑劑和25毫摩爾/升Tricine緩衝液，使體積為0.9毫升，再加入0.1毫升螢光素酶-螢光素試劑，立刻搖勻，置於25℃生物發光檢測儀中進行發光脈衝計數；
e.作標準ATP檢測和培養基與樣品混合不作培養的對照樣液檢測；
f.發光脈衝計數結果：樣品發光脈衝計數CPM樣＝13450，對照樣液CPMCK＝1103；
結果判定：樣品發光脈衝計數CPM樣＞對照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽性。
實例2：果汁飲料的酵母菌和黴菌的MPN法快速測定
果汁飲料通常添加有防腐劑以延長保質期，但剛生產出來的產品其含菌量是很低的，因此要確定含有防腐劑的低菌數樣品的微生物數量，可採用最近似數法（MPN法），對樣品進行檢測：
a.培養基的配製：按國標大腸菌群數量多管發酵法（9管法）配製抗防腐劑型真菌液體大樣檢測培養基（無需在試管中加入小倒管），每管10毫升，並準備其它配套用品，然後滅菌；
b.微生物的培養：在100級超淨工作檯中，將已混合併分散好的樣品按國標大腸菌群數量多管發酵法加入到測定系統中，搖勻混合後在30-32℃下培養12小時；
c.微生物細胞ATP提取方法：各管培養液，於10000轉/分鐘離心5分鐘，去上清液，沉澱加入1毫升微生物細胞ATP釋放劑Ec，作用1～5分鐘；
d.ATP生物發光測定方法：吸取0.1毫升樣品ATP提取液於發光管中，加入適量解抑劑和25毫摩爾/升Tricine緩衝液，使體積為0.9毫升，再加入0.1毫升螢光素酶-螢光素試劑，立刻搖勻，置於25℃生物發光檢測儀中進行發光脈衝計數；
e.作標準ATP檢測和培養基與樣品混合不作培養的對照樣液檢測；
f.結果表示：樣品發光脈衝計數CPM樣＞對照樣液CPMCK，即為樣品帶菌陽性；記錄樣品陽性管數，查MPN表，即得結果，樣品含菌量為460MPN/100毫升。
樣品量 | 發光脈衝計數（CPM） | 陽性管教 | MPN/100毫升 |
10毫升 | 33180 | 3 | 460 |
10毫升 | 43129 | ||
10毫升 | 29037 | ||
1毫升 | 8159 | 3 | |
1毫升 | 9804 | ||
1毫升 | 9311 | ||
0.1毫升 | 7576 | 1 | |
0.1毫升 | 1004 | ||
0.1毫升 | 998 | ||
對照樣裸 | 1011 | / | / |
榮譽表彰
2014年11月6日，《微生物抗干擾快速檢測方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
