基本介紹
- 中文名：差示分析法
- 建立者：L ing
- 建立時間：1992 年
- 優點：快速、簡便、敏感等
- 缺點：假陽性高
改進過程,發展過程,基本方法,
改進過程
L ing 在1992 年建立的mRNA 差示技術具有快速、簡便、敏感等優點, 但存在著假陽性高的缺點, 目前, 國內學者利用這種方法篩選出真正意義的cDNA 片段並不多。1993 年, L isit syn 等建立了representational difference analysis (RDA ) 方法, 它可以篩選出兩個基因組之間的差異基因或基因片段。受Lisit syn 的啟發, 1994 年Hubank和Schatz 建立了cDNA [representat ional difference analysis (cDNA RDA )]方法, 可以篩選mRNA 的差異表達, 具有快速、敏感、重複性好、假陽性率低、不需同位素等優點。
發展過程
分別提取處理組(A ) 與對照組(B) 的RNA 或mRNA , 反轉錄成cDNA , 用識別4 個鹼基的內切酶DpnÊ (M boÉ ) , 將兩組適量的cDNA 充分酶切, 再經PCR 擴增, 即得到每一個樣品的呈線性片段, 所得到的混合物稱為擴增子, 接著擴增子經過連續數次的扣除交叉雜交、動力富集並進行差異PCR 擴增, 使試驗者 (處理組作為Tester) 群體中存在, 而在驅動者(對照組作為D river) 中不存在的片段迅速得到富集, 最終篩選出差異片段。
基本方法
其基本方法如下。
(1) 引物設計。
R 12 5’2 GA TCTGCGGTGA 23’
R 24 3’2 ACGCCACTCTCCGACCTCTCACGA 25’
J 12 5’2 GA TCTGTTCA TG23’
J 24 3’2 ACAA GTACCTA TCA GCTGCA GCCA 25’
N 12 5’2 GA TCTTCCCTCG23’
N 24 3’2 AA GGGA GCCTA TCGTGTCAACGGA 25’
DpnII 酶切雙鏈cDNA 產生粘性末端, R 24 和R12、J 24 和J 12、N 24 和N 12 退火後兩兩互補可形成DpnII 的酶切位點。3 對接頭(引物) 中, 1 對(可用R24、R 12) 製備擴增子, 另外2 對用於雜交和擴增的過程中。在相連的兩輪PCR 反應中, 不能使用相同的1對接頭, 否則上輪反應中未酶切完全的非靶序列(非差異片斷) 仍會部分擴增, 從而影響靶序列的純度。
(2) 提取處理組和對照組的mRNA , 反轉錄成cDNA。
(3) 用識別4 個鹼基的內切酶Dpn II(M bo I) 在37℃將兩組雙鏈cDNA 充分酶切。
(4) 純化經Dpn II酶切的cDNA , 加入R24、R12 及DNA 連線酶連線。
(5) 以R24 為引物分別擴增處理組和對照組。
(6) 純化擴增產物分別用Dpn II 充分酶切, 切掉R24 的接頭, 即得到擴增子作為D river。
(7) 更換接頭, 連線J 24、J 12 到擴增子, 建立1 個試驗者群體。
(8) Tester以1∶100 分子比例與D river 混合, 在95～ 96℃變性4 m in, 67℃雜交至少21 h, 在兩cDNA 群體間成對比較(例如群體A →B) , 同時作A →B 和B→A 兩種比較效果更好。雜交有TesteröD river、D riveröD river、TesteröTester 3 種結果。
(9) 用J 24 引物PCR 擴增, TesteröD river 雜交體只能以單引物擴增, 產物數量呈線性遞增, 產物均為單鏈DNA , TesteröTester 雜交體可以被擴增, 分子數呈指數遞增, 且為dsDNA 分子, D riveröD river 雜交體由於沒有J 24 引物退火區域, 不能進行PCR 擴增, 產物用M ung Bean N uclease 處理, 去除單鏈DNA 分子, 差異cDNA 完成了第一輪富集。
(10) 第一輪富集產物用Dpn II 酶切掉R 24 接頭連上N 12、N 24 接頭, 按1∶400 比例與D river 雜交、擴增,M ung BeanN uclease 消化單鏈DNA , 實現第二輪差異cDNA的富集, 如實驗需要可進行第三、四輪雜交(1 ∶800)。
(11)No rthern b lo t 分析, 排除假陽性片段, 來自差異cDNA 的片段進行克隆, 檢測表達分析。
