小鼠肺移植早期再灌注損傷中NETs作用的可視化研究

《小鼠肺移植早期再灌注損傷中NETs作用的可視化研究》是依託同濟大學，由王興安擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：小鼠肺移植早期再灌注損傷中NETs作用的可視化研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：王興安
• 依託單位：同濟大學

中文摘要

補體主導的免疫攻擊是再灌注損傷主因，但抑制補體的諸多嘗試差強人意。我們假設，補體激活因供者肺泡巨噬細胞受損、中性粒細胞外陷阱（NETs）滯留而盛，隨受者單核細胞分化為巨噬細胞、NETs被清除而衰。在B6=＞B6肺移植，首先確定NETs滯留與持續補體激活的關聯。A1-A3組供肺分別經歷1h、24h、72h冷缺血，再灌注不同時間點獲取標本。活體多光子螢光顯微成像觀察NETs附近巨噬細胞與中性粒細胞動態變化。其次，改變巨噬細胞吞噬功能或局部核酸酶水平，觀察其對NETs和補體激活的影響。B1組取肺前誘導供者巨噬細胞凋亡，B2組受者再灌注後立即輸注巨噬細胞。B3組關胸前胸內滴注DNase 1。最後用肺再移植模型模仿體外灌流裝置，受損肺在第一受者調理24h，再植入第二受者後損傷有望減輕。本研究將明確肺巨噬細胞損傷-NETs滯留-補體持續亢進的關鍵機制，NETs有望成為肺再灌注損傷治療靶。

結題摘要

原發性移植物功能障礙（PGD）是肺移植術後危及生命的嚴重併發症，缺血再灌注損傷（IRI）通常被認為是PGD的主要原因。中性粒細胞胞外陷阱（NETs）可促進無菌炎症。我們假設，補體激活因供者肺泡巨噬細胞受損、中性粒細胞外陷阱 （NETs）滯留而盛隨受者單核細胞分 化為巨噬胞、NETs被清除而衰。 首先，我們確定了B6 小鼠同基因移植肺中NETs累積和持續補體激活之間的相關性。冷缺血（CI）1h，72h或96h的供肺在再灌注後24h發生不同程度的損傷。 RNA測序證明補體系統在IRI中被激活。雙光子成像顯示,隨著IRI嚴重程度的增加，NETs積壓越來越多。蛋白質印跡分析表明肺泡巨噬細胞功能失常。 其次，我們確定了DNase對NETs的影響。雙光子成像顯示，在靜脈注射DNase後NETs溶解，但更多的中性粒細胞募集。組織學顯示，NETs溶解處的肺泡結構嚴重受損，並有大量炎性細胞浸潤。 DNase治療似乎釋放了NETs中的蛋白酶，導致局部的肺損傷。 這個現象在用DNase治療的肺囊性纖維化患者中也有報導。進一步研究表明，NETs片段通過激活募集的單核細胞刺激先天免疫反應。 第三，確定了NETs在IRI中的作用。長時間的冷缺血會在再灌注後誘導壞死性凋亡（necroptosis）。96 h冷缺血24h再灌注之後，移植肺顯示典型的壞死性凋亡的病理：氣道上皮細胞腫脹、呈半透明，但胞核和細胞膜保持完整。免疫組化p-MLKL染色確定，受累的細胞主要是氣道上皮細胞，而血管內皮並未明顯受累。冷缺血誘導的IRI可導致氣道上皮受損，通過pMLKL多聚體形成的孔隙釋出。通過抑制PAD4阻止NETs的正常釋放，結果上皮損傷加重，大量胞漿內容為被釋放。由於NETs碎片的過量累積，C3a和C5a的激活被上調，導致非經典Ly6C - 單核細胞的募集。 Ly6C -單核細胞轉化為促炎巨噬細胞（M1），招募更多的經典單核細胞和中性粒細胞。 總之，NET是一柄雙刃劍。一方面，NETs可以封堵IRI中凋亡性壞死引起的細胞滲漏；另一方面，如果NETs的碎片積壓，將持續激活補體系統，導致固有免疫反應的激活。 外源性DNase會溶解DNA纖維，釋放有毒的蛋白酶和細胞因子，從而加劇移植肺損傷。