《家蠶核型多角體病毒lef-11基因對病毒增殖的調控研究》是依託西南大學，由潘敏慧擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：家蠶核型多角體病毒lef-11基因對病毒增殖的調控研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：潘敏慧
- 依託單位：西南大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
家蠶是重要經濟昆蟲, 同時也是鱗翅目模式昆蟲。家蠶核型多角體病毒是家蠶重要病害家蠶核型多角體病的病原，由於其侵染增殖的分子機制未完全解析，阻礙了家蠶抗BmNPV病毒的抗性機制解析和家蠶抗病毒育種進程。本項目在前期研究中通過對BmNPV編碼基因進行逐一沉默，篩選到了病毒複製增殖的關鍵基因lef-11。本項目擬採用分子生物學和生物信息學等方法，鑑定LEF-11核定位信號，揭示其核轉運機理；構建lef-11基因敲除病毒，解析其對病毒增殖的分子調控機制；通過免疫共沉澱技術篩選並鑑定與LEF-11互作的宿主蛋白，分析過表達lef-11的家蠶細胞中的差異表達基因，闡明LEF-11調控宿主細胞的分子機理。通過本項目研究，可完善BmNPV侵染增殖的分子機制和揭示BmNPV與家蠶的互作機制；可為解析家蠶抗BmNPV病毒的抗性機制、加快家蠶抗病毒育種進程以及開發高效的生防製劑奠定基礎。
結題摘要
家蠶（Bombyx mori，B. mori）是一種具有很高經濟價值和文化價值的泌絲昆蟲，以家蠶為基礎的蠶桑產業曾是我國經濟發展中的功勳產業。家蠶核型多角體病毒（B. mori nucleopolyhedrovirus， BmNPV）病是養蠶生產上最常見的危害最嚴重的一類蠶病之一，每年給我國蠶桑業產業造成巨大的經濟損失。但是目前其侵染機制及其調控宿主細胞作用機制仍然不是很清楚。為了解析BmNPV和宿主相互作用機制，為家蠶抗病育種提供靶標基因，本研究以家蠶核型多角體病毒lef-11基因為研究對象，採用分子生物學和生物信息學等手段，鑑定到LEF-11是一個13.1 KDa的小分子蛋白，確定LEF-11核定位信號位於aa72-101，揭示其能夠和核轉運蛋白相互作用進入細胞核，參與病毒DNA複製。亞細胞定位發現LEF-11在細胞中能夠聚集到一處，非還原性SDS-PAGE結果表明LEF-11主要以四聚體的形式存在，LEF-11 C端多聚化功能域位於aa42-61，N端多聚化功能域位於aa72-101。通過Bac-to-Bac系統回復缺失多聚化功能域的LEF-11，鑑定了該多聚化功能域對病毒DNA複製是必要的；同時，對LEF-11多聚化功能域疏水性胺基酸定點突變，確定I55、Y58&I59、I85、L88&L89對LEF-11蛋白四聚體形成和病毒DNA複製是必要的。利用酵母雙雜交技術和免疫共沉澱技術，確定有6個蛋白與LEF-11具有相互作用，分別是BmATAD3A、BmHSPD1、BmIMPI、BmSamui、BmMyosin及BmROBL2；過表達和敲出LEF-11互作蛋白後流式分析和Western Blotting顯示BmATAD3A、BmHSPD1、BmIMPI和 BmMyosin都具有明顯抑制病毒增殖複製的作用。研究表明BmATAD3A和BmHSPD1均能夠和線粒體共定位，通過RNAi分析表明BmHSPD1基因對病毒複製的影響主要是受BmATAD3A調控。最後以ATAD3A為靶標基因構建了轉基因品系，該品系能夠高效抑制病毒複製。以上結果基本確定了LEF-11調控宿主細胞的網路模型，鑑定了LEF-11劫持宿主ATPase酶家族作用機制，創製了家蠶抗病毒素材創。該研究補充了BmNPV關鍵基因功能驗證，完善了LEF-11劫持宿主細胞作用機制，為家蠶抗病育種提供了優秀的素材。
