天藍色鏈黴菌中DNA甲基化依賴型限制系統的發現與表征

《天藍色鏈黴菌中DNA甲基化依賴型限制系統的發現與表征》是依託上海交通大學，由賀新義擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：天藍色鏈黴菌中DNA甲基化依賴型限制系統的發現與表征
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：賀新義
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

鏈黴菌屬細菌除了產生大約4000種以上的抗生素和難以記數的次級代謝產物外，還普遍存在強烈的DNA甲基化依賴型（IV）限制系統，大大限制了鏈黴菌的基因操作，而它們是什麼卻幾乎未知。模式菌株天藍色鏈黴菌至少包含四種IV型限制系統，前期實驗和分析暗示：它們同其它細菌中報導的能切割同類型甲基化序列的限制酶差異很大。本研究擬從天藍色鏈黴菌入手，通過比較基因組學，高通量文庫篩選等技術手段，克隆到天藍色鏈黴菌中所有的IV型限制酶基因，體外表達這些限制酶並鑑定它們識別和切割甲基化DNA的位點，期望在識別和切割機制等基礎理論方面為IV型限制帶來新的認識；另一方面，希望從這些IV限制酶中找到能夠與脊椎動物基因組中異常超甲基化m5CpG島結合的蛋白,它們具有發展成早期預測特定癌症工具的潛力。

結題摘要

在原核生物中，DNA甲基化和限制系統幾乎總是相伴而生的，隨著噬菌體出現甲基化，羥甲基化，糖羥甲基化 DNA，細菌也發展出了對應IV 型限制系統。 鏈黴菌能夠產生 70%以上的抗生素並廣泛存在 DNA 甲基化依賴型的IV限制系統，這些限制系統對鏈黴菌的分子遺傳學和抗生素代謝工程研究造成了困擾，但是它們是什麼卻一無所知。而在真核生物中，CpG 島異常的超甲基化是導致多種疾病的因素， 所以，鑑定和發現能夠特異性結合到m5CpG 上的蛋白或者酶是非常重要的，它們當中相當一部分是IV型限制酶。 本研究以模式鏈黴菌為出發菌株，擬從以下三個方面進行研究：（1）克隆天藍色鏈黴菌中所有的 DNA 甲基化依賴型的 IV 限制酶基因；（2）在大腸桿菌中表達純化候選限制酶，最佳化其在體外切割甲基化 DNA 的最佳條件，確定其對應的識別序列和切割位點。（3）構建一個將所有限制基因都敲除的多突變菌株，可作為鏈黴菌異源表達的通用宿主。 取得了如下結果：（1) 對能切割甲基化DNA的ScoMcrA（Sco4631）進行了結晶，解析了其初步結構，發現了一個非典型的結合5mC DNA的結構域，類似於真核細胞中的SRA（SET and Ring-associated domain）,它能夠特異性結合5mC。（2) 克隆和表征了一個SRA-HNH雙結構域的蛋白Sco5333，它能結合全甲基化、半甲基化以及單鏈甲基化DNA，結合5mC DNA時，沒有任何DNA序列特異性，Sco5333區分5-甲基胞嘧啶和正常胞嘧啶的差異可達100倍以上，對5-甲基胞嘧啶的結合力比商業化的MeCP2高2倍。定點突變結果顯示Sco5333結合5-甲基胞嘧啶是由SRA結構域決定的，而它對dcm+的大腸桿菌的體內毒性卻需要SRA和HNH兩個結構域的共同作用。 該項具有以下科學意義：目前SRA-HNH在細菌包括鏈黴菌中非常普遍，但是它們均注釋為未知功能的蛋白，Sco5333可以富集DNA上任何位置的5-甲基胞嘧啶，它比現有的同類商業化蛋白更有套用前景。已發現的Sco4631和Sco5333均具有SRA結構域，也許IV限制性內切酶通過其SRA結構域高效特異結合到5-甲基胞嘧啶上，使得HNH結構域在結合位點附近可以高效持續地切割DNA，從而達到限制外來DNA，而最大限度的降低對自身的毒性的目的。