多光子雷射掃描顯微鏡

多光子雷射掃描顯微鏡

多光子雷射掃描顯微鏡，是建立在雷射掃描顯微鏡技術基礎上的實驗方法，在三維觀察上提供了更優秀的光學切片能力。

多光子螢光激發方法使用長波長的紅光或近紅外光採集標本高解析度螢光圖像，對活性標本的殺傷極小，尤其是厚的活組織如腦片、胚胎、整個器官甚至整個機體的成像研究。

基本介紹

  • 中文名：多光子雷射掃描顯微鏡
  • 外文名：Multiphoton Laser Scanning Microscopy
  • 適用於：活細胞成像
  • 專業：光學顯微成像
概述與原理,多光子激發歷程,多光子激發特點,優勢,套用實例,不足,發展展望,

概述與原理

多光子雷射掃描顯微鏡（Multiphoton Laser Scanning Microscopy）採用飛秒雷射器，其驚人的套用之一是敏感的生物結構現象， 它容許的峰值功率密度大於1011 W/cm2, 比傳統雷射共聚焦掃描顯微鏡 105 W /cm2 及通常寬場照明的 50 W /cm2要高許多。
多光子雷射掃描顯微鏡採用波長較長的紅外雷射,能量脈衝式激發,紅外光比可見光在生物組織中的穿透力更強, 因此多光子雷射掃描顯微鏡更能解決生物組織中深層物質的層析成像問題, 擴大了套用範圍。其在生物及醫學成像，單分子探測，三維信息存儲，微加工等領域得到廣泛套用，展示了廣闊的發展前景。
在雷射照射下 ,基態螢光分子或原子吸收一個光子後成為激發態 ,隨後又弛豫到某一基態 ,同時以光子形式釋放能量而發出螢光. 這一過程就是通常的單光子激發情況。
多光子激發基本原理多光子激發基本原理

多光子激發歷程

多光子吸收的歷史可追溯到 1931 年, 當時 M.G.Meier做出了高光強度下多光子吸收會發生的理論預斷， 1961年在貝爾實驗室用脈衝紅寶石雷射器激發銪離子螢光時首次觀察到雙光子吸收，1989 年在美國康奈爾大學 W.Denk 、J.H.Stricker 和 W.W.Webb 製成第一台多光子雷射顯微鏡。此後， 多光子雷射顯微鏡在生物醫學領域發揮了重要的作用。
下面為多光子激發發展歷程中的幾個重要時間節點：
1931，Maria Göeppert-Mayer，理論預言
1970年代，多光子光譜學
1989 ，Denk, Stricklerand Webb (Cornell University, USA)，多光子顯微鏡
1996，Bio-Rad，商業產品

多光子激發特點

  1. 多光子雷射掃描顯微鏡採用波長較長的紅外雷射，能量脈衝式激發，紅外光比可見光在生物組織中的穿透力更強，因此多光子雷射掃描顯微鏡更能解決生物組織中深層物質的層析成像問題。
  2. 多光子雷射掃描顯微鏡採用多光子激發，這是一個非線性過程，具有準確的定位特徵，也就是只有在焦點處的光子才能激發螢光分子，光漂白和光損傷僅局限於焦點附近，且有利於減少測試樣品的自發螢光，這樣可以對活細胞進行更長時間的觀察。
  3. 多光子雷射掃描顯微鏡的螢光激發只發生在焦點，不需共焦針孔選擇螢光，因此測量光路更加簡單、 可靠、 有效，設備簡單易攜，故障率低。
  4. 多光子雷射掃描顯微鏡比雷射共聚焦掃描顯微鏡具有更準確的定位，因而保證了更高的三維解析度，使背景的干擾相對減少，進一步提高了圖像清晰度。
  5. 多光子雷射掃描顯微鏡的螢光波長遠離激發光波長，因此多光子顯微鏡可實現暗場成像。

優勢

  • 利用紅光或紅外光激發，光散射小(小粒子的散射與波長的四次方的成反比）
  • 針孔不能區分由離焦區域或焦點區發射出的散射光子，多光子在深層成像信噪比好
  • 單光子激發所用的紫外或可見光在光束到達焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對深層激發。
  • 在生物顯微鏡觀察方面,最先考慮的是不損壞生物本身的活性狀態，維持水分、離子濃度、氧和養分的流通。在光觀察場合,無論是熱還是光子能量方面都必須停留在細胞不受損傷的照射量、光能量內。
  • 多光子顯微鏡則能夠滿足此,而且還具有很多優點。如三維解析度、深度侵入、在散射效率、背景光、信噪比、控制等方面,均有以往雷射顯微鏡不具備,或具有無法比擬的超越特性。
多光子共焦雷射掃描顯微鏡已延伸到各個研究和套用領域. 它能對處在自然狀態下的樣品進行三維無損觀察 ,並能提高系統的解析度和信噪比.利用多光子激發後材料性質的變化 ,還可以實現三維高度數據存儲和三維任意方向的微細加工 ,具有很高的套用價值. 可以相信 ,隨著與多光子共焦顯微鏡相關的機械、材料、雷射技術等的進一步發展 多光子共焦雷射掃描顯微鏡將得到更大的發展和更廣泛的套用.
高對比度的多光子圖像高對比度的多光子圖像

套用實例

活體動物和腦片神經細胞結構與功能
活體動物腦皮層毛細血管網的成像
胚胎髮育過程的長時間動態觀測
多光子激發光解籠與光激活
細胞內微區鈣動力學
多光子激發自發螢光
其它套用：螢光漂白恢復(FRAP)
螢光共振能量轉移（FRET）
螢光相關譜(FCS)
單分子探測
光動力治療

不足

1、只能對螢光成像。
2、如果樣品包括能夠吸收激發光的色團,如色素,樣品可能受到熱損傷。
3、解析度略有降低,雖然可以通過同時利用共焦的小孔得到改善,但是信號會有損耗。
4、受昂貴的超快雷射器限制, 多光子掃描顯微鏡的成本較高。

發展展望

近年來，科學家利用雙光子或三光子激發完成了以前一直認為是困難和不可能完成的任務，例如，腦組織切 片和整個腦的鈣動態功能成像。在切片中，已用這一方法觀察到特有的枝蔓脊— 大腦電晶體的信息加工。
最近，Webb研究小組將三光子激發的同時吸收用於分泌小顆粒成像。 多於2 個光子的吸收不必要地提供了額外的解析度，但允許接近於激發某些內在螢光團所必需的量子能量。由多光子激發提供的最小損傷顯微術對生物學的開發是極其重要的。研究人員已經揭示了多光子顯微術對變化中的有機體延長觀察的可能性。用於雙光 子生物顯微術的優良光源仍是鎖模鈦寶石雷射器。雷射二極體驅動的泵浦源使該器件從笨重的實用的要求中解放 了出來。此外，直接由二極體泵浦的廉價的飛秒光源的開發使多光子顯微術為更廣大的用戶所利用。
最近， W.Denk等人採用雙光子吸收誘導光電流的方法獲得了積體電路的功能圖像。 使用波長大於矽吸收 帶極限的光，能通過晶片直接成像(由於倒裝固定技術和防止從頂面入口的多互聯層，對上述成像技術非常有益)。
成像時，為了激發載流子，吸收是必須的， 但又妨礙了從基片一邊進入。僅限於焦區的雙光子吸收解決了這 一難題並提高了解析度。

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