外顯子捕獲
外顯子捕獲(exon trapping) 是構建一種載體，從其插入片段中識別和回收外顯子序列，從而克隆目的基因。捕獲外顯子的載體pETV—SD是一種反轉錄病毒穿梭載體，即可在不同種生物中如大腸桿菌和酵母，細菌和哺乳動物細胞等進行複製的載體因為凡是有內含子和外顯子的基因在轉錄後都要經過RNA剪接，這就需要有剪接供體(splicing donor，SD)位點和剪接受體(splicing acceptor，SA)位點。因此，SA位點可作為基因的標誌。pETV—咀載體的克隆位點上游有一個“外顯子捕獲序列”(exon trap cassette)，可用來識別載體的插入片段中有無SA位點。
基本介紹
- 中文名：外顯子捕獲
- 外文名：exon trapping
- 方法：構建一種載體
- 目的：克隆目的基因
操作步驟,
操作步驟
(2)將這些重組載體匯總後感染反轉錄病毒的專宿包裝細胞系(ecotropicretroviral packaging cell line)——ψ2細胞系。ψ2細胞提供蛋白質產物使載體(自身不能合成病毒蛋白質)成為反轉錄病毒在細胞里增殖。當反轉錄病毒在細胞內轉錄時，如果插入片段中包含有功能的SA位點，則有可能發生RNA剪接反應而將IVS切除。
(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包裝在病毒子(virion)中，從細胞培養液中收集後用來感染兼宿反轉錄病毒包裝細胞系(amphotropic retroviral packagingcell line)PA-317。這使反轉錄病毒再進行一輪複製，並產生能感染猴腎細胞系COS細胞的高效價病毒原種。這樣做是由於上一輪克隆在病毒中的插入片段的剪接效率極低，而在第二輪複製時則大大提高了RNA剪接的機會。
(4)從第二個細胞系PA-317細胞中分離得到的病毒，用來感染組成型產生SV40T(腫瘤)抗原的COS細胞。病毒RNA基因組被反轉錄，並在載體上的SV40複製起點作用下，以環狀DNA附加體形式進行複製。
(5)從COS細胞中回收複製的附加體DNA，經限制性內切酶Dpn I 酶切後轉化細菌。在含卡那黴素(Kn)和5—氯—4—溴—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的培養基上挑選轉化子。盧—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成藍色產物。因此，不產生β—半乳糖苷酶的轉化子菌落則呈白色。
(6)只挑選出白色菌落作進一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二種原因。一是由於基因發生突變，使夕—半乳糖苷酶失去活性；二是由於在反轉錄病毒生活周期的RNA時期中發生了剪接反應，從而丟失了α,β—半乳糖苷酶基因。
(7)如果是基因突變，則大多數將是缺失了載體中的“外顯子捕獲”部分，就可用人的口—珠蛋白基因片段為探針作菌落雜交，很快可得到驗證。
(8)如果是真正發生了RNA剪接事件，準確的剪接反應可切除作為標記的IVS，使人口—珠蛋白基因的第1外顯子與落入了捕獲陷阱的插入片段中的外顯子序列連線，這可直接測定其序列加以證明。
從捕獲到的外顯子出發，就可進一步用作探針去從基因組基因文庫或cDNA文庫中分離出基因。
