噬菌體SWU1殺菌過程中ROS的作用及產生機制研究

《噬菌體SWU1殺菌過程中ROS的作用及產生機制研究》是依託濟南大學，由樊祥宇擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：噬菌體SWU1殺菌過程中ROS的作用及產生機制研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：樊祥宇
• 依託單位：濟南大學

項目摘要

申請人前期研究發現噬菌體SWU1可誘導宿主菌產生ROS，但目前國內外研究並不清楚噬菌體殺菌過程中ROS的作用及產生機制。為解決以上科學問題，我們將利用SWU1分別侵染ROS清除劑預處理及過氧化物酶過表達的宿主菌，測量細菌存活率及噬菌體一步生長曲線，證明ROS參與噬菌體殺菌過程；利用ELISA檢測被SWU1侵染宿主菌中蛋白質和核酸的氧化損傷標記物，明確SWU1誘導的ROS可導致氧化損傷；利用qRCR檢測被SWU1侵染宿主菌中糖酵解途徑基因的轉錄水平，通過比色法檢測胞內NAD+/NADH，證明SWU1激活細菌糖酵解途徑，富集NADH；構建NADH氧化酶缺失株及3-磷酸甘油醛脫氫酶缺失株，利用螢光探針檢測SWU1侵染缺失菌中過氧化氫和ROS濃度，測量細菌存活率，明確糖酵解產生的NADH在SWU1誘導ROS產生中的作用，最終闡明ROS被噬菌體誘導產生的機制。有助於指導基於噬菌體的新型抗菌藥研發。

結題摘要

噬菌體作為細菌的病毒、天然的抗菌劑，對其殺菌機制的研究將極大地促進新型抗菌藥物的研發。除噬菌體的經典殺菌途徑之外，噬菌體也可以誘導宿主菌產生活性氧簇（ROS）進而促進宿主死亡，但目前國內外研究並不清楚噬菌體殺菌過程中ROS的作用及產生機制。本項目組試圖揭示噬菌體誘導宿主菌產生ROS的機制。然而，在進一步實驗過程中，我們發現噬菌體SWU1及其宿主恥垢分枝桿菌並不是一個理想的直接研究噬菌體誘導ROS機制及殺菌作用的模型。因此，本項目研究工作轉向通過RNA-seq技術解析噬菌體SWU1在侵染宿主菌過程中，誘導菌體產生ROS的機制。我們檢測了未感染、SWU1感染早期、中期和晚期的恥垢分枝桿菌的轉錄組。轉錄組比較分析發現與未感染的恥垢分枝桿菌相比，被噬菌體SWU1感染早期的細菌內有1174個差異表達基因；被噬菌體SWU1感染中期的細菌內有1821個差異表達基因；被噬菌體SWU1感染晚期的細菌內有1662個差異表達基因。進一步分析數據發現在SWU1感染的早、中、晚期都誘導了大量與ROS防禦相關基因的表達量上調，說明SWU1的感染過程誘導宿主菌產生了ROS。分析代謝途徑相關基因發現，糖酵解代謝被激活。推測SWU1正是通過激活糖酵解途徑，大量積累NADH，進而過度氧化產生ROS。項目組試圖尋找更有效的用於研究噬菌體誘導宿主菌產生ROS機制及殺菌作用的模型。在這一指導思想下，分離鑑定了一株全新的分枝桿菌噬菌體Shandong1，兩株全新的大腸桿菌噬菌體SRT7和SRT8，一株新的銅綠假單胞菌噬菌體SRT6，並對它們進行了全基因組測序及基因組和比較基因組學分析。將噬菌體Shandong1劃歸為分枝桿菌噬菌體Cluster K類，將SRT7劃歸為T7-like噬菌體，將SRT8劃歸為T1-like噬菌體的Tunalikevirus屬。其中兩株大腸桿菌噬菌體具有更強的殺菌能力，有潛力作為研究噬菌體誘導下細菌中ROS產生及殺菌機制的模型，更深入的研究還在繼續進行。相應研究結果揭示了噬菌體SWU1感染宿主時產生ROS的機理，豐富了對噬菌體殺菌能力的理解，有助於指導以噬菌體為基礎的新型抗菌藥研發；不同噬菌體的分離為相應感染性疾病的噬菌體治療提供了依據。