基本介紹
- 中文名：單細胞培養
- 外文名：single cell culture
- 器皿：培養碟
- 優點：高精準、高純度、高存活率
- 也稱：游離細胞培養
定義及介紹,單細胞分離,培養方法,
定義及介紹
單細胞培養(single cell culture)是指從植物器官、愈傷組織或懸浮培養物中游離出單個細胞，在無菌條件下，進行體外生長、發育的技術。人們分離和培養植物單細胞的構想和實踐都比較早，但成功地進行單細胞培養是隨著更有效的培養基的發展以及從愈傷組織懸浮培養物分離單細胞的專門技術的建立才實現的。
高等植物的單細胞在體外特殊條件下通過細胞分裂形成細胞團，進而通過器官或胚胎髮生形成完整植株，這是植物組織培養的一大成功之處。同時，由於植物組織培養中細胞之間在遺傳、生理生化上所出現的種種變異，因而通過對單細胞培養獲得的單細胞無性系，可以用來研究細胞生物學個體再現過程的研究，生產醫學、食品等所需要的次生代謝產物，進行突變體誘導及篩選，細胞融合，產生融合雜種，還可以進行基因轉導、微注射、載體導入，無論在理論上還是在實踐上都具有重大意義。
單細胞分離
從植物器官分離單細胞
分離單細胞的最佳材料是葉組織，因為葉片中的細胞近似於一個同質細胞群體，較適合於特定和調控的大規模細胞培養。用機械法或酶解法可以從這種完整植物體器官(如葉細胞)分離出單細胞。
1 機械法
指通過機械磨碎、切割植物體從而獲得游離的單細胞。用機械法可大規模地對薄壁組織細胞進行分離。
2 酶解法
從培養組織中分離單細胞
從培養組織中分離單細胞指將愈傷組織反覆繼代培養，再轉移至液體培養基振盪培養。這是獲得單細胞使用最廣泛的一種方法。將表面消毒後的植物器官新鮮切片放置在培養基(固體)上，培養基含適當比例的生長素和細胞分裂素，以保證組織培養的順利進行。外植體切口處形成愈傷組織，逐漸生長擴展到外植體組織的整個表面。將愈傷組織從外植體上分離，轉移到成分相同的新鮮培養基上，促使愈傷組織生長。在瓊脂培養基上反覆繼代培養，使愈傷組織結構疏鬆，為建立優質細胞懸浮系打下基礎。液體培養基分裝在經高壓滅菌後的三角瓶或其他培養瓶中，轉入未分化和疏鬆的愈傷組織塊。然後，將三角瓶或培養瓶置於台式搖床或適宜設備上，持續振盪培養。振盪培養的培養基對愈傷組織塊產生適度的壓力，將愈傷組織分離成游離單細胞和小細胞團。此外，加強培養基和培養瓶內空氣之問的氣體交換，並使培養基中細胞和細胞團分布均勻。
培養方法
平板培養法
將製備好的單細胞懸浮液，按照一定的細胞密度，接種於適當厚度的薄層固體培養基上進行培養的方法，稱為平板培養。
等量的單細胞培養液與等量熔化(30～50℃)的瓊脂培養基(0．6%～1%)混合，迅速鋪板於培養皿中，瓊脂冷卻凝固後，細胞分布均勻地被固定在薄層(厚度大約1mm)培養基中。培養皿用石蠟膜封閉，在25℃黑暗或漫射光照射下培養。培養皿可以在倒置顯微鏡下觀察，用優質記號筆在培養皿外側標記單細胞的位置，以便 跟蹤觀察這些細胞的生長和再生，確保篩選出純的單細胞無性系。
看護培養法
有些植物細胞，一旦分離出來，不僅不能分裂、增殖，還可能死亡。看護培養法是用一塊愈傷組織來哺育單細胞，使其正常分裂和增殖的培養方法。用微量移液管或小勺，將來自懸浮培養物或愈傷組織的單細胞轉移到漂浮的定量濾紙上，濾紙下是旺盛生長的愈傷組織。幾天之後，在愈傷組織看護影響下，在一般培養基中沉寂的細胞開始分裂生長。
細胞懸浮培養法
用液體培養基對保持良好的分散狀態的單個細胞或小的細胞聚集體於搖床上進行培養的方法，稱為細胞懸浮培養法(cell suspension culture)。依據培養目的不同，可分為淺層培養和深層培養。淺層培養是指使培養材料的一部分裸露於液體培養基表面，採用靜止培養的方式，適用於各種器官和組織的培養。深層培養是將培養材料沒人液體培養基中，同時採用振盪(或旋轉)培養的方式，適用於愈傷組織、單細胞的增殖培養和胚狀體的培養。其特點為：①能大量提供均勻的植物細胞，即同步分裂的細胞；②細胞增殖速度快，適用於大規模工廠化生產；③需要特殊的設備，如連續培養裝置、倒置式顯微鏡等，成本較高。
微室培養法
人工製造一個小室，將單細胞培養在小室中的少量培養基上，使其分裂、增殖形成細胞團的方法，稱為微室培養法，亦稱為雙層蓋玻片法。其操作是將攜帶1個細胞的1滴培養基置於無菌載玻片上，並用無菌礦物油包圍培養基液滴。再分別在培養基液滴的兩側滴1滴礦物油，在每一礦物油滴上放一張蓋玻片。然後，把第三張蓋玻片放在培養基液滴上，並與其他2張蓋玻片相連，在礦物油內形成包含單細胞的無菌微室，礦物油阻止微室中的水分散失，但允許氣體交換。將微室載玻片置於培養皿中培養，一旦肉眼可見到細胞團，立即揭開蓋玻片，轉移到新鮮液體培養基或半固體培養基上繼代培養。微室培養法的特點是：①能夠在顯微鏡下追蹤觀察單細胞分裂增殖形成細胞團的全過程；②培養基少，營養和水分難以保持，pH值變動幅度大，培養細胞僅能短期分裂。
