單分子生物物理，物理學與分子生物學交叉學科。
基本介紹
- 中文名：單分子生物物理
- 所屬學科：生物學
運用單分子操縱與實時視見技術研究單個生物大分子〔蛋白質、脫氧核糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)等〕的運動軌跡，或它們相互作用的時間過程以及動力學，從而使生命活動過程認識達到分子水平。歷史背景 20世紀90年代以前，對細胞內生物大分子的物理、化學性質的研究，都是根據集群測量得出的，這只是反映大量分子的平均行為。近年來，這種“試管生物物理”有了革命性的發展，由20世紀80年代物理學家發明的單分子操縱技術，如由掃描隧道顯微鏡(STM)開發出來的原子力顯微鏡(AFM)、光鑷、流場拖曳、磁鉗，可對單個生物大分子施以力或力矩，並測量它們的物理性質（如DNA彈性、蛋白質的力學變性等）及力學生化反應（如分子馬達）。分子馬達是能夠利用化學能來做功的生物大分子的統稱，它們包括肌球蛋白、驅動蛋白、RNA聚合酶和拓撲異構酶等。1993～1994年，三個小組美國S.布洛克、美國J.斯普迪赫和日本柳田敏雄首次測量肌球與驅動蛋白的單分子馬達力信號。1997年，日本木下一彥領導的小組看到了單個ATP酶分子中的γ−亞單元在“生物燃料分子”腺苷三磷酸(ATP)供應下的“步進電機”式轉動，即360°是由三次120°完成，而120°轉動是由90°加30°兩個檔級進行的。這些單分子實驗克服以往“試管試驗”的靜態不整與動態不整兩個根本性弱點，給出分子實時行為與性質的分布，避免了對集群測量苛刻的同步要求。利用單分子技術研究酶的催化反應已可把底物結合、水解、或其他催化步驟區分開來。酶促變數（如催化速率等）作為時間的分布函式的積分同時也給出了集群的性質。雖然大多數集群性質可由其單分子數據平均得到，但反之則不能成立，如DNA的解鏈、蛋白質的摺疊是不可能由集群性質得到的。除了單分子操縱，單分子實時視見也是近幾年單分子生物學的發展熱點。細胞活體研究中，螢光蛋白（GFP和DsRed）的發現開闢了螢光單分子檢測的新領域，並涉及物理光學的最新技術，如近場掃描光學顯微鏡和廣野顯微鏡等。皮牛頓力學 生物大分子（如分子馬達）運動或轉動主要靠ATP水解獲得能量。一個ATP分子水解能約20kT，這裡k是玻耳茲曼常數，T是溫度。kT＝4×10–12焦，分子馬達移動尺度約10納米，因此一個ATP驅動的力約為5皮牛。DNA解鏈實驗中，需要打開互補鹼基對的氫鍵。蛋白質變性（去摺疊）實驗涉及胺基酸殘基間“非共價”的鍵，以及疏水作用，它們所需的力約在100皮牛範圍。蛋白質分解、DNA和RNA酶切涉及斷開共價鍵，所需的力是最強的單分子力，約1 000皮牛。但這對於無生命的固態物理實驗，只相當於在0.1納米晶格做1電子伏功所需的力。因此，單分子生物物理所需的力是非常微弱的力，其檢測實現要晚於固態物理是可想見的。單分子操縱與視見技術 對DNA、RNA拉伸時，這些生物高分子的一端是固定在固體表面，另一端連線在一種力敏感單元，它們可由AFM或光鑷直接施力操縱，測量其位移便可確定生物大分子所受的力。AFM的懸臂可測量到毫秒間0.1納米的位移及大於10皮牛的力。一般的AFM玻璃微絲在體積上大於懸臂，因此時空解析度不如後者，但測力精度可達到皮牛或0.1皮牛級。光鑷可測到亞秒時間內的皮牛力與納米的位移。由巴黎高師統計物理實驗室發明的磁鑷技術的力敏單元是一種磁性顆粒，垂直移動磁場或旋轉磁場可同時對生物大分子施力或力矩。單分子實時視見，主要依據入射光激發的生物分子內源螢光團或發光團受激斯托克斯發射。技術關鍵在於被激活的容積要小（如納升或飛升），這才能保證激活容積中只有一個分子與雷射共振。對於無內源光團的生物分子，可加一個螢光基團，如綠色螢光蛋白(GFP)到待測分子上去，即所謂的螢光蛋白探針。GFP探針與螢光顯微鏡技術已經帶來活細胞單分子實時視見的革命，如2001年美國《科學》周刊報導了單個病毒顆粒進入細胞膜及核的全過程。複雜的熵彈性 對雙鏈DNA(dsDNA)單鏈DNA(ssDNA)以及RNA二級結構的單分子力學實驗的理論解釋已帶來高分子物理的一場革命。生物高分子不同於傳統高分子，表現在序列的非均勻性、序列之間相互作用的特異性，以及序列高級結構引起的序列之間的“遠程作用”。這裡的“遠程”不是空間意義上的遠距離作用，而是由於高分子鏈隨機彎曲而使延鏈相隔甚遠的序列在空間變成近鄰的相互作用。這種複雜相互作用，給生物大分子的單分子力學（無論是平衡還是遠離平衡）帶來了一些基本的統計物理新問題。一條高分子鏈的自由能(F=U–TS)是由內能U與熵能(−TS)組成的，這裡T是溫度，S＝klnω是構形熵，ω是構形數。如果單分子力還不能引起共價鍵的破壞，則影響的僅是熵能的改變。如果鏈的首尾端距很小，這時的鏈有無數的構形（S大，自由能低）。如果首尾端距增大，則構形數必定減少（在極端的直鏈情況構形只有一種），即自由能升高。用單分子力拉伸生物高分子的過程會像拉彈簧一樣增加鏈的自由能，故−TS也叫熵彈性能。由於生物大分子序列的複雜性，這種熵彈性已不能用傳統的高分子理論進行描述。如dsDNA單分子拉伸實驗曲線在70皮牛左右出現一個上述理論無法解釋的階躍伸長平台，伸長量達到1.7倍DNAB–形式的長度，被稱之為超伸展的S–形式。DNA的B–形式即沃森與克里克發現的DNA雙螺旋標準形式。中國學者1999年把DNA鹼基對相互作用引入dsDNA的彈性問題，很好地解釋了B–S結構相變。對更複雜的ssDNA與RNA的拉伸實驗的理論解釋仍然是理論生物物理挑戰性的難題。DNA與蛋白質的單分子相互作用 用單分子拉伸DNA可觀察到DNA與蛋白質相互作用的事件。如由於加入酶蛋白於所拉伸的DNA溶液，則隨著酶濃度增加，DNA的力–伸長與力矩–伸長曲線會呈現不同的結構相變平台。若加入的是拓撲異構酶，它與DNA的作用就是改變DNA的超螺旋度，即改變其擰數或扭曲數（如拓撲酶Ⅱ可使DNA鬆開兩圈），因此作用發生時會實時記錄幾十納米的躍變伸長。類似的現象還發生在DNA與解螺旋酶、RNA聚合酶、轉錄因子、核酸外切酶的相互作用。這些酶在DNA複製、轉錄時起作用，解開或擰松DNA雙螺旋，引起力–伸長曲線出現實時變化。反過來，用力與力矩可改變DNA的構形，改變其與ATP及上述各種酶的結合能力，因此單分子操縱已成為一種調控酶的活性的新參數。這些用單分子技術直接研究生物大分子之間的相互作用是2000年分子生物學最大的進展。
