《著絲粒粘連蛋白E 的單分子生物物理學研究》是依託中國科學技術大學，由周金華擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：著絲粒粘連蛋白E 的單分子生物物理學研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：周金華
- 依託單位：中國科學技術大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
在細胞有絲分裂過程中，著絲粒粘連蛋白E（CENP-E）在染色體運動和排列、紡錘體檢驗點失活以及中心紡錘體可塑性等方面具有重要的功能地位。目前有關CENP-E的研究多集中在對其在細胞內的功能表現、相互作用蛋白以及調控途徑等方面，而能夠反映CENP-E本身性質的單分子研究還很少。我們擬採用全內反射螢光顯微鏡和光鑷技術，在單分子層次上評估馬達蛋白CENP-E沿微管蛋白行走過程和測量它們相互作用的單分子力譜，研究(1)CENP-E與微管表面作用的基本動力學特性及構-效關聯；(2) 蛋白激酶BubR1的磷酸化作用對CENP-E單分子特性的調節作用；(3)CENP-E的小分子抑制劑syntelin對CENP-E單分子運動行為的影響;(4)在微管聚合/解聚過程中CENP-E與微管相互作用的動力學特性。利用物理學方法評估CENP-E的單分子行為，為全面闡明馬達驅動蛋白在有絲分裂中的系統生物學奠定基礎。
結題摘要
在細胞有絲分裂過程中，著絲粒粘連蛋白E（CENP-E，屬於Kinesin-7）在染色體運動和排列、紡錘體檢驗點失活以及中心紡錘體可塑性等方面具有重要的功能地位。目前能夠反映CENP-E 本身性質的單分子研究很少，並且缺乏統一的共識。在該項目一年的資助和中國科大姚雪彪教授提供生化條件的支持下，我們攻克單分子操縱的實驗方法和高精度光鑷系統搭建等難關，實現了對CENP-E的單分子操縱。 首先以活性好的Kinesin-1為對象摸索掌握單分子檢測方法，在我們光鑷系統上檢測到了Kinesin-1的運動速度（461nm/s）和馬達域與微管蛋白之間的解離力，其結果均與國際文獻結果一致。在相同ATP濃度下檢測， CENP-E沿微管蛋白運動速度（30.6nm/s）比Kinesin-1要慢很多，這一現象結果與加州大學Cleveland課題組（JCB，2008）採用全內反射觀察運動速度的結果相近，而與哥倫比亞大學Rosenfeld課題組（PNAS,2008）採用光鑷開展的單分子檢測結果差別較大。此外，在光阱中CENP-E的解離力小於Kinesin-1。關於CENP-E單分子特性有待深入驗證，後續工作還將開展單分子測量CENP-E的動力參數和結合蛋白影響下CENP-E的單分子特性。 理論模擬（勢能模型和蒙特卡洛方法）Kinesin的運動規律以指導單分子實驗。kinesin沿微管運動的速度隨著ATP濃度增大而增大，當ATP濃度達到毫摩爾時，速度趨於穩定值。在施加光阱力作為負載時，Kinesin運動速度將變慢，這與我們實驗觀察結果一致。在ATP濃度較低時，kinesin馬達域與微管蛋白相互作用承受的張力越大，kinesin反而停留在微管蛋白的時間越長。 在本項目中搭建高精度光鑷系統是深入開展單分子實驗的前提，我們設計搭建一套適合單分子生物物理研究的高精度光鑷系統（設備經費另籌），具有光阱力＞100pN，達到2nm的空間解析度等特性；提出了“一種俘獲及探測復用的掃描光鑷系統”系統設計（申請發明專利）；採用矢量光線追跡模型研究不規則顆粒的光阱力發表在Optics Express（物理類二區）。 在本項目資助下，我們已經建立了單分子研究生物大分子相互作用的技術方法和物理模型，檢測到了CENP-E單分子的直接信息，其進展是後續研究CENP-E的動力參數和結合蛋白影響下CENP-E的單分子特性的重要前提。
