反相離子對色譜法

反相離子對色譜法是把離子對試劑加入到含水流動相中，被分析的組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子生成不帶電荷的中性離子，從而增加溶質與非極性固定相的作用，使分配係數增加，改善分離效果。

基本介紹

• 中文名：反相離子對色譜法
• 外文名：ion pair reversed phaser chromatography
• 類型：學術語
• 儀器：  美國HPll00高效液相色譜儀

反相離子對色譜法

（ion pairreversed phase chromatography )

反相離子對色譜法的套用

反相離子對色譜法測定魚腥草素鈉的含量

儀器與試藥

1．1 儀器 美國HPll00高效液相色譜儀，VWD紫外一可見光檢測器，HPl 100化學工作站，Rheodyne手動進樣器，日本島津UV-265FW自動記錄分光光度計，SB3200超音波清洗器。

1．2 試劑 乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸、醋酸、醋酸銨、四丁基氫氧化銨、四丁基溴化銨均為分析純，超純水。

1．3 對照品與樣品 魚腥草素鈉對照品(中國藥品生物製品檢定所，批號為：0247-9601)；魚腥草素鈉原料(上海漢殷藥業有限公司，批號為：990701，010301，030101，030301、040101)

2 測定方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Cs 5μm，150 mn×4。6 mm；流動相：2mmol/L四丁基氫氧化銨溶液．乙腈(64：36)；流速：1。0mL/min；檢測波長：283 nm；柱溫為室溫；進樣量為20 μL。

2.2 色譜條件選擇

2．2．1 檢測波長及溶劑選擇 取魚腥草素鈉對照品，用流動相超聲溶解並製成約8μg/mL的溶液，進行紫外掃描。魚腥草素鈉能完全溶解並在283 nm處有最大吸收，故以此波長為檢測波長，流動相為溶劑。

2．2．2 柱溫選擇 取同一樣品溶液，於同日分別在室溫(22℃)、柱溫為42℃下各進樣兩針，結果魚腥草素鈉的理論塔板數依次為8 898、8 900、8 899、8 899，RSD為O．1%；峰面積依次為168 685、167 633、164 638、167 185，RSD為1．0%。說明柱效幾乎不變，柱溫對檢測無影響，為避免加溫對色譜柱的損害，所以採用室溫作柱溫。

2。3 供試品溶液的製備

取乾燥至恆重的魚腥草素鈉適量，精密稱定，加流動相超聲溶解並稀釋成含魚腥草素鈉約為24 μg/mL的溶液，搖勻，即得。另取魚腥草素鈉對照品，同法製備對照品溶液。

2．4 方法學驗證

2．4．1 線性關係考察 取魚腥草素鈉對照品，用流動相溶解並稀釋製成每1 mL含魚腥草素鈉O．080 1 mg的溶液，即為儲備液，精密取儲備液o．5，1.0，1．5，2．0，3.0，5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻即得。吸取上述儲備液及稀釋溶液各20μL注入液相色譜儀，依法測定，每個濃度重複進樣2次，記錄峰面積。分別以濃度C為橫坐標，峰面積A的平均值為縱坐標，求得魚腥草素鈉的線性回歸方程：A=1．289 5×10-2C+1．634 2×10-4，r=O。999 9；線性範圍為：80．1—1 602μg/mL。

2．4．2 精密度試驗 精密吸取魚腥草素鈉對照品溶液，注入液相色譜儀，記錄峰面積，RSD值為1．O%(幾=6)。

2．4．3 穩定性試驗 取同一樣品溶液於o，6，20，36，42，66h測定，記錄峰面積，魚腥草素鈉峰面積6次測定值的RSD為0．9%，表明樣品溶液在66 h內穩定。

2.4．4 重複性試驗 取同一批樣品(030301)3份，依法測

定，平均含量為100。6%，RSD為1．3%。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品5份，遞增添加魚腥草素鈉對照品溶液適量，依法製備和測定。魚腥草素鈉的平均回收率為99．6%，其RSD為1．0%。結果見表1。

3 樣品測定

取魚腥草素鈉原料5批，依法製備供試品溶液。分別取對照品溶液、供試品溶液進樣，用面積外標法計算，並用碘量法測定進行比對，結果見表2。

4 討論

4.1 檢測方法的選擇 魚腥草素鈉易溶於熱水，在水或乙醇中微溶，極性與對乙醯氨基酚相似，用其滴劑的反相檢測方法，以C18(5 I．Lm，4．6mm×150mill)為固定相，不同比例的甲醇．醋酸與醋酸銨緩衝液(pH6。o)為流動相檢測，均無峰檢出。再將流動相改為不同配比的磷酸．水．甲醇，三乙胺．水．甲醇試驗，仍未果。

參考了青黴素的反相離子對色譜法檢測後，採用反相離子對色譜法，用短鏈固定相，C8(5 I．Lm，4．6 mm×150 mm)色譜柱，在流動相中加入反離子試劑四丁基溴化銨，有峰檢出，但分離效果差；改加四丁基氫氧化銨，以2 mmol/L四丁基氫氧化銨溶液．甲醇(31：69)為流動相試驗，峰型有改善，可保留時間很短(約3。5 min)，見圖工(A)。將甲醇改為乙腈試驗，效果良好，見圖1(B)。試驗了不同配比，最終以2 mmol/L四丁基氫氧化銨溶液．乙腈(64：36)為流動相，效果最好。

4．2 反離子試劑的用量與流動相的pH 流動相中反離子試劑四丁基氫氧化銨的用量應控制在1．6—2．2 mol/L。用量低於1．6 mol/L，由於親和力太低，起不到反離子效果；用量超過2．2 mol/L時，pH值過大，達9。O以上，易損壞色譜柱。經試驗，四丁基氫氧化銨的用量在2．0 mmol/L時，pH值為7．2，效果最好。

反相離子對色譜法測定馬來酸噻嗎洛爾

1　儀器、藥品與試劑

島津LC-10AD泵，SPD-10A紫外檢測器，CTO-10A柱溫箱，C-R6A數據處理機。

馬來酸噻嗎洛爾(天津中央製藥廠)，馬來酸噻嗎洛爾滴眼液(天津市售產品)，輔料及中間產物(天津中央製藥廠)。

乙腈(色譜純)，磷酸二氫鈉(化學純)，辛烷磺酸鈉(山東禹王實業總公司化學試劑廠)。

2　色譜條件

色譜柱：YWG-C18(10 μm,4.6 mm×250 mm)；流動相：0.065%辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩衝液[取磷酸二氫鈉1.56 g，加水1000 mL,用磷酸(1→10)調節pH至3.50±0.05，加入辛烷磺酸鈉0.65 g使溶解，搖勻]-乙腈(70∶30)；流速：0.7 mL·min;檢測波長：297 nm；積分儀衰減：0；紙速：1.5 mm·min；靈敏度：0.05 AUFS；柱溫：40 ℃，理論板數不低於2 000。

3　實驗方法

3.1　色譜條件的選擇　經過對不同磷酸鹽、不同濃度(0.02，0.01，0.005 mol·L)緩衝溶液與甲醇或乙腈以不同配比(65∶35，70∶30，75∶25)篩選，並對加入不同離子對試劑(己烷磺酸鈉及辛烷磺酸鈉)，比較其不同濃度(0.085%，0.065%，0.045%)，不同pH條件(pH=3.0,pH=3.5)。最終選擇0.01 mol·L磷酸二氫鈉緩衝液[用磷酸(1→10)調pH=3.5]配製的0.065%辛烷磺酸鈉溶液與乙腈(70∶30)組成的流動相為最佳條件(圖1)。另以流動相溶解原料作紫外掃描，最大吸收297 nm為檢測波長。

3.2　線性實驗　精密取馬來酸噻嗎洛爾適量(約相當於噻嗎洛爾12.5 mg)置200 mL量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度。分別精密取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置25 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，進樣20 μL,以濃度(μg·mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，得到噻嗎洛爾的回歸方程：

Y=875.19X-137.05　r=0.999 3

結果表明濃度在3.0～11.2 μg·mL範圍內，線性關係良好。

3.3　有關影響因素實驗　取生產廠提供的馬來酸噻嗎洛爾中間體噻二唑、唑烷進行實驗，均對主峰無影響(圖2)。另按滴眼液處方配製空白輔料溶液，在規定的色譜條件下，基本為一直線，對本實驗也無干擾。

3.4　精密度實驗　精密稱取馬來酸噻嗎洛爾(980102批)適量(約相當於噻嗎洛爾12.5 mg)，置25 mL量瓶中，用流動相溶解並稀釋至刻度，搖勻，重複進樣6次，噻嗎洛爾RSD=0.35%,馬來酸RSD=0.44%，有較好的精密度。

3.5　加速實驗　將原料藥980102批及滴眼液980502光照27 d後，實驗結果見表1。原料藥經光照後比較穩定，色譜圖無變化，滴眼液色譜圖有明顯改變(圖3)，雜質峰增多，含量下降。本實驗說明，該方法能夠反映出樣品的變化，可以控制產品質量。

4　樣品測定4.1　原料藥　取本品(約相當於噻嗎洛爾12.5 mg)，精密稱定，置25 mL量瓶中，加流動相使溶解並稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取對照溶液20 μL注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰高約為記錄儀滿量程的10%～20%，再取供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍(主成分保留時間應在10 min後)，除馬來酸峰之外，供試品溶液的色譜圖中如有雜質峰，量取各雜質峰面積的和不得大於對照溶液的峰面積。結果見表3。

4.2　滴眼液　精密量取本品1 mL(約相當於噻嗎洛爾5 mg)置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度作為對照溶液，照上述方法檢查，應符合規定。

5　討論5.1　實驗中流動相比例的調整，以主峰保留時間在10 min之後為宜，馬來酸峰與相鄰雜質峰基線分離較好。

5.2　方法中規定記錄色譜圖為主峰保留時間的3倍，是由於原料藥中間體噻二唑的保留時間約為26 min，實驗中970601批滴眼液中檢出該雜峰。

5.3　本實驗供試液自然放置24 h後複測，溶液濃度不變，雜質量不增加，比較穩定。