基本介紹
- 中文名：分子篩層析
- 外文名：gel filtration
- 別名：凝膠過濾
原理,種類與性能,試驗方法,凝膠的選擇,凝膠預處理,裝柱,加樣與洗脫,洗脫液收集,使用與保存,
原理
凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時，由於它們的分子量不同而表現出速度的快慢，在緩衝液洗脫時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先後流出凝膠柱，達到分離的目的。
種類與性能
葡聚糖又名右旋糖酐，在它們的長鏈間以三氯環氧丙烷交聯劑交聯而成。葡聚糖凝膠具有很強的吸水性，交聯度大，吸水性小，相反交聯度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交聯度越大，吸水性越小，G值越大，交聯度越小，吸水性就越大，二者呈反比關係，G值大約為吸水量的10倍。由此可以根據床體積而估算出葡聚糖凝膠乾粉的用量。
表1－8 Sephadex1的種類與特性
G25、G50有四種顆粒型號：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、細（20µ~80µ）和超細（10µ~40µ）。G75～G200又有兩種顆粒型號：中（40µ～120µ），超細（10µ～40µ）。顆粒越細，流速越慢，分離效果越好。
表1－9 DEAE－纖維素與Sephadex1比較
試驗方法
凝膠的選擇
凝膠預處理
稱取適量的凝膠加入過量的緩衝液在冰櫃（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時間應根據不同型號的凝膠而定（）。
為使粒子均勻一致需進行浮選，即加入凝膠粒子後，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉澱的粒子，如此反覆數次即可。
裝柱
層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時，柱床體積應為樣品體積的25～100倍。去鹽、游離螢光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當。內徑過細，會發生“器壁效應”，即靠近管壁的流速要大於中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例。對於除鹽來說應為1︰5～1︰25；對於純化蛋白質來說應為1︰20～1︰100。
裝柱過程基本同離子交換層析柱。
加樣與洗脫
樣品體積不宜過多，最好為床體積的1%～5%，最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。
洗脫液應與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會發生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩衝鹽溶液（0.14Mol/L NaCl）。
洗脫液收集
同離子交換層析。
使用與保存
當樣品的各組分全部洗脫下來之後，即可加入新的樣品，繼續使用。保存方法有三種：
⑴ 在液相中保存最方便，即於凝膠懸液中加入防腐劑（一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高壓滅菌後4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
⑵ 用完後，以水沖洗，然後用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態下保存。
